DEHP的降解及其对土壤细菌群落的影响

王佳斌 朱凤晓 高娟 施维林*

1 背景及意义

PAEs是一类重要的环境内分泌干扰物[1]，主要被用作塑料产品增塑剂[2]。PAEs与塑料分子主要依靠氢键和范德华力结合而不是共价键连接[3],因此PAEs极易在生产、使用和焚化掩埋等过程中释放到水、空气和土壤环境中。我国工农业区土壤均已遭受PAEs不同程度污染[4]，含量一般在μg/kg至mg/kg数量级[5]。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯 (DEHP)，是一种重要的PAEs类化合物，也是目前世界上应用广泛和生产量大的人工合成的有机污染物之一[6]。其化学结构式如图1所示。

图1 DEHP的化学结构

DEHP具有较好的脂溶性，对生物体和固体颗粒表现出很强的亲和性和吸附性[7]。DEHP和邻苯二甲酸丁酯(DBP)，在大气、水体、土壤和底泥中的检出率和含量都较高[8]。例如广州和深圳蔬菜生产基地土壤中的Σ6PAEs 为 3.0-45.7 mg/kg，DBP 和DEHP为主要组分，含量分别为ND-20.6 mg/kg和2.85-25.1 mg/kg[9]。DEHP 对生物体的慢性毒性效应备受关注。虽然没有明显的急性毒性作用，但在大剂量情况下，对动物具有致癌、致畸、致突变作用，显示出较强的内分泌干扰性[10]。DEHP的主要代谢产物为MEHP，同DEHP一样，对动物细胞有致突变作用[11]，可对幼鼠生精功能造成损害[12]。因此，有必要加强DEHP（和MEHP）在环境中的降解机理方面的研究，研发有效的去除方法，以减少对生物健康造成的危害。

图2 土壤中不同浓度DEHP和MEHP的降解注：标有相同小写英文字母的处理之间没有显著性差异（p＞0.05）

在环境中，PAEs的水解、光解和挥发速率非常缓慢，生物降解是其在环境中分解的主要途径[13]。环境中PAEs的降解与分布在很大程度上取决于微生物的群落结构与功能差异，理解微生物介导的PAEs代谢机制可为PAEs环境归趋研究与PAEs修复提供理论基础。但目前对PAEs(尤其是DEHP)降解菌群落结构与功能的认识还非常有限[14]，对PAEs降解的微生物群落效应研究还未展开。因此，本文将考察不同土壤PAEs含量下，DEHP和MEHP的微生物群落效应，以期揭示两种重要污染物在不同状态下的微生物代谢机理。

2 材料与方法

2.1 风干土活化

取风干保存的南京市江宁区蔬菜地土样，添加无菌水至含水率约为60%的最大持水率，在25℃条件下培养10天，以稳定和活化土壤微生物。每种处理需要土壤(7*3)*20=420 g(干重)。需土壤：420*5=2100 g(干重)。无菌对照，每种处理需要4*3*8=96 g(干重)；共 4 种处理，需土壤 384 g（干重）。

2.2 污染物溶液配制

10 mg/mL DEHP溶液：称700 mg DEHP于100mL蓝盖玻璃瓶中，准确加入70 mL丙酮，盖紧盖子，摇动瓶子后，超声助溶。

10 mg/m L MEHP溶液：称700 mg MEHP于100m L蓝盖玻璃瓶中，准确加入70 mL丙酮，盖紧盖子，摇动瓶子后，超声助溶。

2.3 土壤制备

CK:称取干重为 50 g（湿重 59.17 g）的土壤于240 mL玻璃瓶中，添加42 mL丙酮。待丙酮挥发完，倒入盛有干重为370 g（湿重437.87 g）土壤的陶瓷搅拌盆，拌匀。

DEHP100:称取干重为50 g的土壤，添加4.2 mL DEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）和37.8 mL丙酮。待丙酮挥发完，与干重为370 g的土壤拌匀。

DEHP1000:称取干重为50 g的土壤，添加42 mL DEHP溶液（dissolved in acetone,10mg/mL）。待丙酮挥发完，与干重为370g的土壤拌匀。

MEHP100:称取干重为50 g的土壤，添加4.2 mL MEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）和37.8 mL丙酮。待丙酮挥发完，与干重为370 g的土壤拌匀。

MEHP1000:称取干重为50 g的土壤，添加42 mL MEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）。待丙酮挥发完，与干重为370 g的土壤拌匀。

分装100 mL锥形瓶中培养，每瓶含土20g（干重）。补充水分至60%最大持水量。

3 结果与讨论

3.1 DE HP和M E HP的降解

图3 不同浓度DEHP和MEHP对土壤细菌数量的影响

图4 培养42天时，不同浓度DEHP对土壤中细菌群落的影响（门和属水平）注：α-Pro、β-Pro、δ-Pro、γ-Pro和 unclassified-Pro分别表示 α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和unclassified Proteobacteria；蓝色字体代表DEHP抑制菌群；*和**分别表示显著性水平p＜0.05和p＜0.01。

土壤中DEHP100在21天及42天的平均降解率分别为42.1%及51.2%，DEHP1000在21天及42天的平均降解率分别为36.9%及46.0%（图2），总体上在两个浓度下，随着时间的增加，降解率有一定程度的增加，但是DEHP100与DEHP1000降解率之间没有显著性差异。

本实验另设置了MEHP处理组，设置MEHP处理组是因为MEHP是DEHP的重要代谢产物（通常经微生物作用，DEHP首先被降解成MEHP），设置MEHP组可便于考察DEHP中间代谢产物的代谢菌群。图2表示，土壤中MEHP100在21天及42天的平均降解率分别为99.7%及99.9%，DEHP1000在21天及42天的平均降解率分别为97.1%及98.1%，随着时间的增加，降解率一定程度上有所增加，在21天及42天之间没有显著性的差异，但是较高浓度的MEHP1000的降解速率显著低于低浓度的MEHP组的降解速率。实验中没有发现MEHP或其他产物累积，表明在该土壤中DEHP的降解较为彻底。由于MEHP是DEHP的一种代谢产物，其分子量较小，因此MEHP在土壤中被微生物代谢的速率显著高于DEHP。Cartw right[15]及Otton[16]等学者也发现了类似的现象。

3.2 DE HP和M E HP对土壤细菌数量的影响（图3）

另外分析了土壤中的细菌数量，在21天后，空白对照组细菌数量为65.1（*105CFUs/g soil），DEHP100组为72.3（*105CFUs/g soil），DEHP1000为75.6（*105CFUs/gsoil）。DEHP的加入在一定程度上增加了这些异养菌的数量，但是效果不显著。另外MEHP100组为65.5（*105CFUs/g soil），MEHP1000组为60.2（*105CFUs/g soil），与空白对照组没有显著性差异，没有显著增加异养菌数量，反而高浓度的MEHP处理组中细菌数量有所减少。42天后，在空白对照组中生物量为68.7（*105CFUs/gsoil），DEHP100为69.5（*105CFUs/g soil），DEHP 1000为70.3（*105CFUs/g soil）。DEHP的加入在同样一定程度上增加了这些异养菌群的数量，但是效果不显著。MEHP100为70.7（*105CFUs/g soil），MEHP1000为68.3（*105CFUs/g soil），与空白对照组没有显著性差异。Cartwright等人的研究也同样发现DEHP1000ppm对土壤细菌总数没有影响[15]。

3.3 DE HP对土壤细菌群落的影响

为了进一步了解DEHP对微生物菌群的影响，本研究使用高通量测序的手段分析了不同处理土壤中的细菌群落结构和组成（图4）。在实验土壤中，主要菌群为变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），而其他常见菌群如酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和芽单胞菌门（Gemmati-monadetes）所占比例相对较低。在门水平上，DEHP处理对细菌菌群的影响不大，仅有两个门被显著影响：DEHP100处理显著提高了α-变形菌纲（α-Proteobacteria） 的 丰 度 ， 以 及DEHP1000显著降低了芽单胞菌门的丰度。

在属的水平上，我们发现DEHP污染对多个细菌菌群有显著影响。主要表现为：DEHP100显著提高了变形菌门下α-和β-变形菌纲中的一些属；DEHP1000则显著提高了放线菌门下放线菌目中的一些属。此外，两者同时抑制了芽单胞菌门下的芽单胞菌属(Gemmatimonas)。可能的原因是已有报道的降解作用及碳代谢作用。

4 结论

不同浓度DEHP在土壤中降解均较慢，培养42天后降解约50%；其单酯降解产物MEHP在该土壤中可迅速降解，故DEHP降解过程中未检测到MEHP产物残留。培养42天后，DEHP污染对土壤细菌总数和细菌群落结构没有显著影响，表明其急性毒性较低。但两种浓度下均显著改变了一些菌群的相对丰度，可能会引起土壤微生物功能的改变。

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