鳄鱼肉多肽的抗氧化性研究

◎ 刘雅颀，尹晓清，喻志林，郭晓双

（1.湖北瑞邦生物科技有限公司，湖北 荆州 434000；2.北京百生康健康产业有限公司，北京 100020）

鳄鱼有“活化石”之称，具有寿命最长、免疫力最强、终身不患癌症、骨头最硬的特征。鳄鱼的医药价值远在犀角、虎骨之上，在医学上享有“动物黄金”之美誉，因此国内外对其研究日益加深[1-2]。目前。已有许多学者利用生物酶解技术以沙丁鱼、油菜籽、鲢鱼等多种原料制备了许多抗氧化活性多肽[3-5]。据研究报道，鳄鱼肉中含人体8种必需氨基酸，是优势的蛋白资源[6]。除此之外，抗氧化肽是目前国内外研究较多的一种生物活性肽，安全、稳定、高效[7-8]。目前国内外对鳄鱼的研究主要侧重于养殖方面，在对鳄鱼肉多肽抗氧化性研究方面还没有系统性的报道。Zhong[9]只是研究报道相对分子质量＜1 000组分的自由基清除能力较强。

本研究采用0.8%碱性蛋白酶对鳄鱼肉进行酶解，通过减少相对分子质量的大小，进行抗氧化活性研究，探讨鳄鱼肽的生物活性变化，为功能性鳄鱼肉蛋白产物的开发利用提供一定理论基础和应用基础。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

鳄鱼肉由北京百生康提供，于-18 ℃冷冻保存；1,1-二苯基-2-苦基腙肼（DPPH），购于Sigma公司，分析级；硫酸亚铁、三氯乙酸、无水乙醇、浓硝酸、磷酸缓冲液、双氧水、邻非罗啉、三氯化铁，购于中国国药，分析级；甲醇、乙腈、氨基酸标准品购于中国国药，色谱级；碱性蛋白酶 购于诺维信，食品级。

高效液相色谱仪LC-20AT，C18column （250 mm×4.6 mm），日本岛津；紫外分光光度仪mini-1240（Shimadzu公司）；生化培养箱SPX-250B-Z（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2　实验方法

1.2.1鳄鱼肉浆液制备

将鳄鱼肉洗净后，准确称重，切小块加入2倍水，放入均质机中匀浆。

1.2.2鳄鱼多肽液制备

向鳄鱼肉浆液中加入鳄鱼肉质量0.8%的碱性蛋白酶，持续酶解6 h。酶解条件为60 ℃、pH 9.0（加NaHCO3调节pH）。每隔0.5 h取样，高温灭酶，过滤，得到不同酶解时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h和4.5 h）的酶解鳄鱼多肽液。

1.2.3鳄鱼脱色多肽液制备

将鳄鱼多肽液准确量取体积V，加入鳄鱼多肽液质量2%的活性炭，在50 ℃条件下脱色2 h。

1.2.4相对分子质量测定

酶解物相对分子质量分布的测定采用凝胶层析法[10-11]，由Sephadex G-15柱(φ1.1 cm×50 cm)分析检测。

1.2.5抗氧化性测定

1.2.5.1DPPH自由基清除能力测定

利用DPPH醇溶液呈紫色并在517 nm处有强吸收的特点定量测定鳄鱼多肽制备过程中，DPPH清除能力的变化。将1 mg的DPPH溶于无水乙醇，定容至10 mL，配制成0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。取1 mL固形物含量为2%的样品溶液（鳄鱼肉浆、鳄鱼酶解液和鳄鱼脱色液）和4 mL的DPPH醇溶液于棕色带塞试管中，均匀震荡，在室温下避光反应30 min后立即在517 nm处测定其吸光值As。再取1 mL固形物含量为2%样品溶液和4 mL无水乙醇溶液，均匀混合在相同条件下反应，测定吸光值A0。取1 mL蒸馏水和4 mL的DPPH醇溶液均匀混合在相同条件下反应，测定吸光值Ac。按照公式（1）计算鳄鱼酶解不同时间条件下的抗氧化性变化。

式（1）中，A0为空白组吸光值；Ac为对照组吸光值；As为样品测定值。

1.2.5.2羟基自由基（OH）清除能力测定

利用Fenton反应将1.0 mL的7.5 mmol/L邻菲罗啉与2.0 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液，1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亚铁溶液充分混匀。再加入0.1% H2O2溶液，加入1 mL的质量浓度2%的样品溶液震荡均匀后置于37 ℃水浴中反应60 min，在536 nm处测定其吸光度As。再用1 mL的蒸馏水代替样品做空白对照A0。用1 mL蒸馏水代替H2O2，1 mL蒸馏水代替样品，测定吸光值Ac。

式（2）中，A0为空白组吸光值；Ac为对照组吸光值；As为样品测定值。

1.2.5.3超氧阴离子自由基清除能力测定

反应显色体系：4.5 mL pH为8.34的磷酸缓冲液，1.2 mL蒸馏水在25 ℃下保温30 min，加入0.3 mL 25℃的邻苯三酚，4 min后立即在325 nm下测定吸光值Az。另将0.5 mL样品、0.7 mL蒸馏水、4.5 mL的磷酸缓冲液在25 ℃下保温30 min，加入0.3 mL 25 ℃的邻苯三酚，在4 min后立即在325 nm下测定吸光值As。

式（3）中，Az为4 min内邻苯三酚的自氧化吸光值；As样品氧化后吸光值。

2　结果与讨论

2.1　DPPH自由基清除能力

经测定，鳄鱼肉浆清除自由基DPPH能力为48.68%，低于部分鳄鱼肽。如图1所示，不同酶解程度的鳄鱼肽相对分子质量不同，氨基酸的组成不同清除自由基DPPH能力不同。随着酶解程度的不断加深，鳄鱼蛋白不断被水解成多肽、氨基酸疏水基不断暴露，相对分子质量变小。

图1　鳄鱼肉酶解时间对多肽液DPPH自由基清除能力和相对分子质量的影响图

在碱性蛋白酶酶解2 h时，鳄鱼肽分子量为2 200时，鳄鱼肽清除自由基DPPH的能力最强，达到85.4%，远远高于鳄鱼肉浆清除自由基能力46.68%。说明酶解蛋白成小分子肽有利于对自由基DPPH清除能力的提高，有助于鳄鱼功效性提升。但继续酶解鳄鱼蛋白，鳄鱼蛋白继续水解成更小分子，其清除自由基DPPH能力降低。这一趋势说明鳄鱼肽在一定分子量范围内，多肽链具有较强的清除自由基DPPH能力。

2.2　羟基自由基（OH）清除能力

如图2所示，酶解时间越长，鳄鱼肉多肽液中的相对分子质量逐渐减小，其羟基自由基清除能力逐渐增加到平稳趋势，考虑到鳄鱼肉多肽液的活性，发现酶解时间在2 h时，在相对分子质量为2 200时，羟基自由基的清除能力高达83.479%，与其DPPH自由基清除能力相呼应，说明相对分子质量过低，酶解时间过长，其鳄鱼肉多肽液的生物活性反而不是最高。

图2　鳄鱼肉酶解时间对多肽液羟基自由基清除能力和相对分子质量的影响图

2.3　超氧阴离子自由基清除能力

如图3所示，酶解时间越长，鳄鱼肉多肽液相对分子质量逐渐减小，其超氧阴离子自由基清除能力逐渐增加，考虑到鳄鱼肉多肽液的活性，发现酶解时间在2 h时，在相对分子质量为2 200时，超氧阴离子自由基的清除能力高达75.976%，但是都低于DPPH和OH自由基的清除能力，高于其他鱼肉自由基清除能力，与其DPPH自由基、羟基自由基清除能力相呼应，说明相对分子质量过低，酶解时间过长，其鳄鱼肉多肽液的生物活性反而不是最高。

图3　鳄鱼肉酶解时间对多肽液超氧阴离子自由基清除能力和相对分子质量的影响图

3　结论

经过碱性蛋白酶酶解后的鳄鱼肉多肽液对DPPH、OH和超氧阴离子自由基的清除能力不同，且酶解时间对其影响也是不同程度的变化的，而酶解时间过长会导致相对分子质量的大大减小，导致多肽含量过高，生物活性降低明显。当酶解时间为2 h时，相对分子质量为2 200时，鳄鱼肉多肽液对DPPH、OH和超氧阴离子自由基的清除能力分别是85.4%、83.479%、75.976%，表现出较好的抗氧化性，具备作为天然抗氧化剂的潜力。