益气养阴活血方对糖尿病大鼠肝脏病理及肝脏miRNA-126表达水平的影响*

刘 颖 ，张 军 ，赵 静，王海英 ，王军媛 ，王明星，刘晓曼 ，王顺意 ，戴金颖，袁 洁

糖尿病的发生、发展不仅取决于遗传因素，而且也受到表观遗传修饰的调控，有研究表明miRNAs与糖尿病的发生发展密切相关[1]，但两者之间的互相影响的机制比较复杂，目前仍无定论，但通过改变或者修饰相关miRNAs的表达，可作为糖尿病诊疗的新靶点，已成为近年来研究的热点。胰岛素抵抗（IR）是2型糖尿病主要发病机制之一，课题组前期研究发现，益气养阴活血中药可以改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗[2]，本研究通过测定miRNA－126在肝脏组织的表达，探讨益气养阴活血方改善胰岛素抵抗的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级Wistar大鼠60只，体质量200～250 g，雄性，12周，饲养于华北理工大学动物实验室，自由饮食、摄水，温度21～25℃，湿度50%～60%，明暗周期（12 h/12 h）。动物购自中国人民解放军军事医学科学院环境医学研究所，许可证号SCXK－（军）－2014－0001。

1.2 药物 自拟益气养阴活血方：黄芪12 g，太子参 12 g，熟地黄 15 g，黄精 9 g，牡丹皮 9 g，丹参15 g，三七粉 3 g，鬼箭羽 15 g，山茱萸 9 g，葛根 15 g，麦冬9 g，为中药免煎颗粒，购自中国中医科学院广安门医院，津力达颗粒（以岭药业），购自唐山市中医医院。

1.3 主要仪器 血糖仪（拜耳公司）、Cobas－8000型全自动生化分析仪（德国罗氏）。Infinite®200 PRO型多功能酶标仪（瑞士帝肯公司）；Ep realplex实时荧光定量PCR仪（德国Eppendorf公司）；

2 方法

2.1 动物分组及模型制备 随机抽取10只作为空白组，予普通饲料，其余50只为实验组，予高脂饮食，小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导形成糖尿病模型，成模后随机分为模型组、津力达组、益气养阴活血方低、中、高剂量治疗组5组（以下简称低、中、高剂量组）。

2.2 干预方法 除空白组及模型组，其余4组分别给予相应药物灌胃，津力达组以津力达颗粒3.0 g/kg灌胃，益气养阴活血方按成人剂量换算低、中、高剂量组分别为 13.75、27.50、55.00 g/kg，每日上午灌服1次，空白组和模型组给予等量生理盐水，干预4周。

2.3 取材及指标检测

2.3.1 生化指标 观察各组大鼠的空腹血糖（FBG）及餐后2 h血糖（2 hBG），空腹胰岛素水平（FINS），糖化血清蛋白（GSP）。

2.3.2 肝脏细胞病理变化 处死大鼠后取肝脏组织，苏木精－伊红（HE）染色，光镜下观察各组大鼠肝脏组织的病理变化。

2.3.3 qRT－PCR测定mi－RNA含量 提取肝脏组织总RNA，进行逆转录反应，准备引物：miRNA－126、U6 PCR引物及茎环引物，离心机离心，开盖，DEPC水溶解稀释，置于－20℃冰箱中备用。qRT－PCR扩增反应：逆转录合成的cDNA，反应条件：95℃、10min，95 ℃、15 s，61 ℃、30 s，40 cycles，反应结束后做扩增曲线、熔解曲线分析。PCR扩增完成后，调整基线及阈值。目的基因计算公式：目的基因相对量=2－ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因－Ct内参基因。

2.4 统计方法 所有的数据使用SPSS22.0进行统计，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠FBG、2 hBG、GSP、FINS和体质量比较 与空白组相比，模型组和各治疗组FBG、2 hPG、GSP明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，各治疗组FBG、2 hPG、GSP 明显降低（P＜0.05）；与津力达组相比，中剂量组2 hPG降低（P＜0.05）。与空白组相比，模型组和各治疗组FINS明显升高（P＜0.05），模型组体质量明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，各治疗组FINS、体质量明显降低（P＜0.05）；与津力达组相比，中剂量组 FINS降低（P＜0.05）。见表 1～2。

3.2 益气养阴活血方对糖尿病大鼠肝脏组织的影响 HE染色结果显示：空白组肝脏具有正常的结构，肝小叶清晰可见，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，排列整齐，肝细胞胞质均匀丰富，无水肿及脂肪变性，无明显病变。模型组肝脏结构破坏明显，肝小叶界限模糊不清、肝细胞索排列紊乱，肝细胞肿胀，呈弥漫性脂肪变性，部分细胞核溶解，间质组织大量炎症细胞浸润，呈现片状坏死灶，肝中央静脉及肝窦可见部分淤血。津力达组及益气养阴活血方治疗各组肝脏病理损害较模型组明显改善，肝小叶、肝细胞索基本结构存在，肝细胞肿胀及脂肪变性较模型组减少，间质少见炎症细胞，淤血程度较模型组减轻，见图1。

表1 益气养阴活血方对糖尿病大鼠FBG、2 hBG、GSP的影响（x±s）

表2 益气养阴活血方对糖尿病大鼠FINS、体质量的影响（x±s）

3.3 各组大鼠肝脏组织miRNA－126表达水平的比较 与空白组相比，模型组及津力达组，低、中、高剂量组miRNA－126表达均升高（P<0.05）；与模型组相比，各治疗组 miRNA－126表达均降低（P＜0.05）；与津力达组相比，中剂量组miRNA－126表达明显降低（P＜0.05），见表 3。

4 讨论

图1 各组大鼠肝脏组织比较（HE×400）

表3 益气养阴活血方对糖尿病大鼠肝脏组织miRNA-126表达的影响（x±s）

IR发病机制复杂，而miRNA－126可对胰岛素作用靶器官肝脏产生影响，从而改善胰岛素抵抗。钱荣立等[3]发现在ob/ob大鼠肝脏和GK骨骼肌中，miRNA－126的含量显著上升。何亚非[4]发现正常人肝细胞内miRNA－126表达上升时，细胞对胰岛素敏感性下降，从而发生肝脏胰岛素抵抗，葡萄糖代谢紊乱。其作用机制推测与导致胰岛素受体后缺陷有关，胰岛素受体后缺陷主要包括胰岛素信号转导中胰岛素受体功能障碍、受体底物酪氨酸磷酸化水平增强、PI3K和蛋白激酶B（PKB）活性下降、葡萄糖转运子4（GluT4）表达和转导受阻、Ras途径异常等。张东泽等发现[5]过表达miRNA-126大鼠胰岛β细胞株（INS-1）能够抑制胰岛素受体底物（IRS-1）、磷酸肌醇3激酶调节亚单位（PIK3R2）和蛋白激酶B（Akt）的表达水平，证实 miRNA-126可能通过调控IRS-1和PI3K信号通路，从而调控胰岛β细胞的增殖，调节胰岛的生长发育，参与IR的发生。Ryu等[6]观察到在肝细胞中，miRNA-126通过调控其靶基因IRS-1，导致IR，肝细胞内miRNA-126的过表达，肝组织对胰岛素的反应性下降，胰岛素代偿性增多出现胰岛素抵抗。

中医多认为气阴两虚兼血瘀是胰岛素抵抗发生的关键病机，益气养阴化瘀法能够抑制大鼠体质量下降和血糖升高，调节血清INS水平[7-8]。临床研究发现益气养阴活血中药可增强胰岛素敏感性，防治胰岛β细胞功能损伤[9-10]。因此，课题组在治疗上确立了益气养阴、活血化瘀之法，自拟益气养阴活血方，攻补兼施、标本同治，临床疗效显著。本实验选取的津力达颗粒，功效益气养阴，健脾运津，多项临床及实验研究表明，可改善糖、脂代谢及胰岛素抵抗[11-12]。

本研究结果可以看出，益气养阴活血方可以改善血糖代谢，降低体质量，降低空腹胰岛素水平。肝脏细胞染色可以看出，津力达组及益气养阴活血方治疗各组肝脏病理损害较模型组明显改善。qRTPCR结果显示，与模型组相比，津力达组及中药各剂量组miRNA-126表达明显降低，益气养阴活血方中剂量组比津力达组降低更明显。从而得出结论，益气养阴活血方可能通过调控miRNA-126表达改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗，改善血糖代谢。另外，益气养阴活血方中剂量组在降低血糖，改善肝脏细胞病理形态，降低肝脏细胞miRNA-126表达方面疗效优于其他中药各组，提示影响药物疗效的关键还有药物剂量，以达到最优效果的剂量为宜，并非剂量越大越好，但关于中药尤其是中药复方的量效关系有待进一步深入研究。

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[2] 王海英，张 军，刘 颖，等.益气养阴活血方对T2DM大鼠胰岛素抵抗的影响[J].光明中医，2016,31（17）：2496-2498.

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[5]张东泽.MicroRNA对细胞信号转导调控的研究[D].银川：宁夏医科大学,2011.

[6]Ryu HS,Park SY,Ma D,et al.The induction of microRNA targeting IRS-1 is involved in the development of insulin resistance under conditions of mitochondrial dysfunction in hepatocytes[J].Plos One,2011,6(3):e17343.

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