开口箭皂苷对人甲状腺髓样癌TT细胞的抑制作用及对Notch1的影响*

沈 鑫，夏玉坤，张莹雯，周 珍，艾 望，张 朋

甲状腺髓样癌（MTC）是一种神经内分泌肿瘤，来源于甲状腺滤泡C细胞，侵袭性强，早期易发生淋巴转移和血行转移[1]。近二十年来，MTC的发病率急剧升高[2－3]，其发病率约占全部甲状腺恶性肿瘤的3%～5%，病死率高达13.4%[4]。手术切除是治愈MTC的唯一手段，但对于手术无法完全切除或术后复发及有远处转移的患者，由于MTC对放射性I131，促甲状腺激素及化疗不敏感，目前尚无令人满意的治疗方法[5]。因此，寻找治疗MTC更有效的药物是临床治疗迫切需要解决的问题。

开口箭是一种中草药，为百合科铃兰族开口箭属植物，味苦辛、性寒，具有清热解毒、散瘀止痛的功效[6]，可治疗咽喉肿痛、风湿痹痛、毒蛇咬伤。开口箭提取物的主要活性成分为皂苷，开口箭总皂苷（TST）对人结肠癌LoVo细胞、人胃癌BGC－823细胞、人肺腺癌H1299细胞、人肝癌SMMC－7721、HepG2细胞、人乳腺癌MCF－7细胞和直肠癌SW480细胞等多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[7－10]。实验将通过观察TST对MTC－TT细胞增殖的抑制作用及Notch 1信号的影响，进一步探讨TST抗MTC机制，为临床治疗提供新思路。

1 材料

1.1 主要试剂与药物 MTC－TT细胞株购自中科院上海细胞库，开口箭购于武汉大学中南医院中药房，胎牛血清（杭州四季青公司，批号141215），F12k培养基（HyClone公司，批号 SH30023），胰酶溶液（吉诺生物医药技术有限公司，批号GNM25200），细胞周期检测试剂盒（天津三箭生物技术有限公司，批号CY2001－O），CCK8检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，型号C0038），三氯甲烷（国药集团化学试剂，批号 10006818），PrimeScript®RTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa公司，批号RR047A）、SYBR®Premix Ex Taq®试剂盒（TaKaRa公司，批号RR420A），SDS－PAGE凝胶制备试剂盒（ASPEN公司，批号AS1012）、RIPA总蛋白裂解液（ASPEN公司，批号AS1004）、BCA蛋白质浓度测定试剂盒（ASPEN公司，批号AS1086）。

1.2 主要仪器 倒置相差显微镜（Olympus公司，型号IX51），紫外分光光度计（PerkinElmer公司，型号Lambda 45），酶标仪（Diatek公司，型号DR-200Bs），PCR 仪（杭州博日科技，型号 TC-XP），制冰机（常熟市雪科电器有限公司，型号IMS-20），电泳仪（北京市六一仪器厂，型号DYY-6C），流式细胞仪（BD公司，型号FACSCalibur），旋转蒸发仪（BUCHI公司，型号 R-210）。

2 方法

2.1 TST的制备

2.1.1 TST提取 取开口箭干燥根茎1 kg，3L 75%乙醇加热回流提取2 h，反复提取3次。合并提取液，减压蒸馏，得到浸膏加1 L水溶解，置于分液漏斗，500 mL石油醚萃取3次。水溶液用500 mL水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇溶液减压蒸馏，得总皂苷粗品A，水相减压蒸馏得总皂苷粗品B。HPD-100大孔树脂柱层析，总皂苷粗品A依次用3 L 20%乙醇洗脱，10 L 40%乙醇洗脱，最后以10 L 70%乙醇洗脱，收集70%部位。减压浓缩，干燥后呈粉末状，即为开口箭总皂苷，称质量6.16 g。

2.1.2 TST成分及性质检测 泡沫实验及三氯醋酸反应实验均为阳性，确认为甾体皂苷。将适量样品溶解于甲醇中，定容至1 mg/mL浓度。取200μL溶液，60℃挥干溶剂，加入200μL 5%香草醛-冰乙酸溶液和800μL高氯酸，摇匀，60℃恒温水浴加热20 min，冰浴冷却15 min，加入5 mL冰醋酸，摇匀，测定458nm波长处吸光值。TST含量（%）=（W/0.2）×100%={[0.0631+0.2835（Ai-Ac）]/0.2}×100%。W：皂苷含量（mg）；Ai：样品平均吸光度，Ac：空白对照平均吸光度。空白对照样品平均吸光度为0.066 6，70%部位样品平均吸光度为0.610 8。70%部位总皂苷含量为77.13%。

2.1.3 开口箭溶液的配制 用含20%灭活新生小牛血清（FBS）的F12K培养液配制成2 000μg/mL的溶液，其余浓度按需稀释配制，0.22μm的微孔滤过膜过滤除菌备用。

2.2 细胞培养 MTC-TT细胞复苏后用培养基（F12k培养基+20%胎牛血清+1%双抗）培养细胞，于5%CO2、37℃培养箱中常规培养，每3天换液1次，取对数生长期的细胞以0.25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化传代。

2.3 TST对MTC-TT细胞的抑制作用及对Notch1的影响

2.3.1 CCK8法检测TST对MTC-TT细胞增殖抑制率影响 取对数生长期的MTC-TT细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，接种至96孔细胞培养板，每孔100μL，过夜培养使细胞贴壁。24 h后实验组分别加入含 2、4、8、16、32 μg/mL 的 TST，对照组只加细胞不给药，每个浓度设4个复孔。分别于培养24、48、72 h后，取出培养板于倒置相差显微镜下观察细胞形态，吸弃培养基，并按照试剂盒说明书向每孔加入10μL CCK8溶液，37℃孵育4 h，酶标仪450 nm处测定每孔吸光度（OD值）。细胞增殖抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%，每次实验重复3次，以时间为横轴、抑制率为纵轴，绘制各组细胞的生长曲线，并计算IC50值。

2.3.2 实验分组 根据CCK8结果，选取最小IC50值，实验分为4组，对照组（对照组，培养基中无药物）,TST低浓度组（TL，0.5倍 IC50），TST中浓度组（TM，IC50）和 TST 高浓度组（TH，2倍 IC50）。

2.3.3 流式细胞仪检测MTC-TT细胞周期 取对数生长期的MTC-TT细胞，按实验分组设计，实验组给予不同浓度TST，对照组加入等体积培养基，处理48h，胰酶消化后以1000r/min离心5min收集细胞，弃上清，收集细胞，沉淀中缓慢加入预冷的90%乙醇，重悬细胞，4℃孵育20min，1000r/min离心5min收集细胞，用3 mLPBS重悬细胞，300 g离心5 min。加入500μL碘化丙啶PI染液重悬细胞，避光染色20 min，上机检测。

2.3.4 RT-PCR检测Notch1mRNA的表达水平 按实验分组设计，实验组给予不同浓度TST，对照组加入等体积培养基，处理48 h。采用Trizol一步法提取总RNA,第一链cDNA的合成采用PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNAEraser进行，扩增条件为：95℃预变性 1 min，循环 40次（95℃，15 s→58℃，20 s→72℃，45 s），熔解曲线（60℃→95℃，每 20 s升温1℃）。目的基因扩增用ΔΔCT法计算，A=CT（目的基因，实验样本）－CT（内标基因，实验样本），B＝CT（目的基因，对照样本）－CT（内标基因，对照样本），K＝A－B，表达倍数＝2－K。引物序列由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，见表1。

2.3.5 Western blot检测Notch 1蛋白的表达 收集不同浓度TST处理48 h的实验组处理细胞和培养基处理48 h的对照组细胞裂解提取蛋白，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度，以SDS-PAGE分离胶分离蛋白，转膜，将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h，加入已稀释好的一抗4℃过夜，回收已稀释的一抗，用TBST洗3次，每次5 min，加入稀释好的二抗，室温孵育30 min，用TBST在室温下摇床上洗4次，每次5 min，化学发光检测，AlphaEaseFC4.0软件处理目标带的光密度值。

表1 引物序列

2.4 DAPT（Notch1抑制剂）对MTC-TT细胞的抑制作用及对Notch 1蛋白表达的影响

2.4.1 实验分组 将实验分为对照组（培养基中无药物）、TST 组（IC50）、TST（IC50）+DAPT（4.32 μg/mL）组和DAPT组（4.32μg/mL）。

2.4.2 CCK8检测DAPT（Notch1抑制剂）对MTCTT细胞增殖抑制率影响 采用CCK8法观察阴性对照组、TST组、TST+DAPT组和DAPT组作用于MTC-TT细胞48 h时细胞增殖抑制率。

2.4.3 Western blot检测DAPT对Notch 1蛋白表达的影响 采用Western bolt法检测阴性对照组、TST组、TST+DAPT组和DAPT组作用于MTC-TT细胞48 h时细胞Notch1蛋白的表达。

2.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 TST对MTC-TT细胞增殖的影响 TST对MTC-TT细胞增殖具有抑制作用，具有时间—浓度依赖性，见图1。TST作用于MTC-TT细胞24、48和72 h的IC50值分别为59.01、31.54和31.63μg/mL。

3.2 TST对MTC-TT细胞周期的作用 对照组细胞大多处于G0/G1期，经不同浓度TST作用48 h后，MTC-TT细胞周期发生明显改变。相比于对照组，TST中浓度组和TST高浓度组G0/G1期细胞相对减少（P<0.05或 P<0.01），TL、TM、TH 浓度组 G2/M 期细胞增加（P<0.05或P<0.01），细胞阻滞在G2/M期。见表 2、图 2。

图1 TST对MTC-TT细胞增殖的影响

表2 TST对MTC-TT细胞周期的作用（x±s）%

3.3 TST对MTC-TT细胞Notch1的mRNA表达影响 TST低浓度、中浓度、高浓度组Notch1表达水平均高于对照组（P<0.01），TST高浓度组Notch1表达水平最高，Notch1表达呈浓度依赖性，组间比较具有统计学意义（P<0.01），见表3。

3.4 TST对MTC-TT细胞 Notch1的蛋白表达影响 TST低浓度、中浓度、高浓度组Notch1蛋白的表达水平均高于对照组（P<0.05或P<0.01），TST高浓度组Notch1表达水平最高，Notch1表达呈剂量依赖性，组间比较具有统计学意义（P＜0.01），见表 4、图 3。

图2 TST对MTC-TT细胞周期的影响

表3 TST对MTC-TT细胞Notch1 mRNA表达影响（x±s）

表4 TST对MTC-TT细胞Notch1蛋白表达影响（x±s）

图3 TST作用于MTC-TT细胞的Western blot电泳图

3.5 DAPT对MTC－TT细胞增殖的影响 相比于阴性对照组，TST组和TST+DAPT组抑制率显著升高（P＜0.01），DAPT组抑制率与之相比无统计学意义（P＞0.05）；TST组抑制率高于TST+DAPT组和DAPT组，组间比较具有统计学意义（P＜0.01）；DAPT组抑制率低于 TST 与TST+DAPT 组（P＜0.01），见表 5。

表5 DAPT对MTC-TT细胞增殖的影响（x±s）

3.6 DAPT对MTC－TT细胞Notch1表达的影响 阴性对照组中有少量Notch1蛋白表达，与阴性对照组相比，TST组Notch1表达显著升高（P＜0.01），TST+DAPT组Notch1表达无明显变化（P＞0.05），DAPT 组 Notch1表达下降（P＜0.01）；与TST组相比，TST+DAPT组Notch1表达显著下降（P<0.01）；DAPT组的Notch1表达均低于其余 3组（P<0.01），见表 6、图 4。

表6 DAPT对MTC-TT细胞Notch1蛋白表达影响（x±s）

图4 DAPT作用于MTC-TT细胞的Western blot电泳图

4 讨论

目前研究发现，Notch1既是致癌基因，也是抑癌基因，在多种肿瘤细胞中表达上调，包括结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等，在神经内分泌肿瘤（NETs）中表达很低或者缺失[11－12]。由于甲状腺C细胞在胚胎学上系自神经嵴组织演化发育而来，属于神经内分泌细胞，所以MTC是一种神经内分泌肿瘤，Notch1在MTC中表现为抑癌基因作用。Kunnimalaiyaan等[13]发现人甲状腺髓样癌组织和MTC－TT细胞中，Notch1处于失活状态时，NE肿瘤标志物ASCL1、CgA、降钙素均表达较高；强力霉素激活Notch1后，ASCL1表达水平明显下降，进而CgA、降钙素表达水平均下降；Notch1还可通过上调细胞周期调节蛋白P21将细胞抑制在G1/S期，抑制细胞增殖。因此，激活Notch 1信号蛋白，可能是临床治疗MTC的新方法。

实验中，TST可呈剂量依赖性抑制MTC－TT细胞生长，并可使G0/G1期细胞相对减少，G2/M期细胞相对增多，实验表明TST可使细胞阻滞于G2/M期，通过有丝分裂干扰细胞进程，抑制细胞生长。MTC－TT细胞中有少量Notch 1表达，经不同浓度TST处理后，Notch 1的蛋白和基因表达均明显升高，且呈剂量依赖性，表明TST可上调Notch 1表达；为进一步验证TST通过调控Notch 1分子发挥抑制MTC-TT细胞的作用，将TST与Notch1抑制剂DAPT共同作用于MTC-TT细胞，CCK8结果示TST+DAPT组抑制率明显低于DAPT组，验证了TST通过Notch1发挥抑制细胞增殖作用。TST+DAPT组相比于对照组，仍具有一定的抑制作用，提示TST可能还通过其他通路发挥抑制MTC-TT细胞作用，还需进一步研究。结果表明开口箭可抑制MTC-TT细胞增殖，干扰细胞周期，其抑制作用与上调Notch1表达有关。

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