光谱预处理对太赫兹光谱预测猪肉K值的影响

齐 亮，赵茂程*，赵 婕，唐于维一

（1.南京林业大学机械电子工程学院，江苏 南京 210037；2.南京师范大学分析测试中心，江苏 南京 210046；3.泰州学院，江苏 泰州 225300；4.南京工业职业技术学院航空工程学院，江苏 南京 210023）

太赫兹（terahertz，THz）波位于毫米波和红外线之间，属于远红外波段，频率在0.1～10.0 THz范围内[1]。从能量上看，THz波处于电子和光子之间。核苷酸、糖类、DNA、蛋白质、氨基酸等不同类别的生物分子在THz波段都具有各自的特征吸收，其特征吸收主要来自分子的集体振动模。因此，可以通过分析干燥的固态生物材料在时域光谱或频域光谱的特征峰和谱线形状的差异，实现THz光谱无损检测高分子生物物质，如毒品或爆炸物检测[2-3]、药物分析[4-5]、农产品鉴定[6-7]和生物组织鉴别等。

生物组织中肌肉与脂肪的含水率存在差异，研究人员利用水对THz波的吸收效应对猪肉、羊肉、鸡肉等新鲜组织切片以及腊肠、火腿等熟食进行了THz光学特性的检测与光谱成像，获得了组织含水率在THz波段条件下空间分布图[8-11]。此外，正常组织与癌变组织在含水率、生物分子（如蛋白质、DNA等）含量上的差异也会造成THz波吸收效应的不同，可以据此实现病变组织的THz波快速检测[12-13]。但是THz光谱的生物组织鉴别相关研究较少，鲜见用THz光谱检测肉品质的相关报道。

猪肉是一种富含水的生物组织，新鲜程度可以用K值来评价[14]。新鲜程度越高K值越低，反之K值越高。K值通常采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析法获得[15-16]，但是过程耗时，对被测样本具有破坏性，因此无损检测肉样的K值正成为研究的一个方向。表征K值的主要成分核苷酸类（如二磷酸腺苷、三磷酸腺苷）及其相关物质（如肌苷酸）属于生物小分子，其分子自身的转动、振动以及分子集团的整体振动会吸收THz波[17]。因此可以用THz技术测定肉的新鲜程度。

检测前通常采用低温或者脱水处理的方式排除水的干扰、降低光谱噪声以及提高谱峰的可辨性。但脱水和低温处理会改变生物组织的形态，不适合生物组织的无损检测。为无损检测生物组织，需要在合理的THz检测模式基础上寻找合适的光谱预处理方法，以削弱水对THz波的干扰。本实验探讨不同预处理方法对猪肉K值的THz无损检测影响，研究出更适合K值预测的光谱预处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料

猪肉样本均为宰后排酸12 h的猪通脊肉，购于南京市学衡路苏果超市。

1.2 仪器与设备

TAS7500SP THz光谱分析仪 日本Advantest公司；Finnigan surveyor HPLC仪、Biofuge Stratos台式高速离心机 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

实验及数据处理流程如图1所示。

图1 实验及数据处理流程图Fig.1 Flowchart showing the experiment and data processing procedures

1.3.1 样本制备

将采购的新鲜猪通脊肉切割成2.5 cm×2.5 cm×0.5 cm的肉片，取样时避开猪肉的脂肪和结缔组织，用保鲜袋包裹后置于4 ℃冰箱中贮藏，使其自然缓慢腐败，期间随机选取样本进行光谱信息的采集和K值的测定。

1.3.2 THz光谱采集

THz光谱分析仪工作的环境温度为（25±1）℃，相对湿度为50%～65%，频率分辨率为7.6 GHz，检测频率范围为0.1～2.0 THz，共250 个采样频率点（波点）。为提高光谱信噪比，样本的谱线经过2 048 次自动扫描并平均后得到。

THz与水有强烈的相互作用，对于富含水的肉样透射深度只有几百微米，所以透射模式不适合肉制品新鲜度无损检测，反射模式也会因为反射波被水吸收而无法检测。用THz衰减全反射（attenuated total reflectance，ATR）检测模式，可以克服样本中富含的游离水以及结合水对THz波的强烈吸收，使得样本表面微米级厚度化学物质的THz特性能够反映在THz全反射波的光谱里[18]。

测量前，仪器先预热0.5 h，使得仪器各部件达到热平衡，以减少传感器的温度漂移、光谱数据的基线平移。样本检测前先测量背景，仪器自动存储背景光谱，并在测量样本时自动扣除背景光谱的干扰。每隔0.5 h重新测量一次背景，并更新背景光谱，以减少仪器长时间运行过程中光谱基线的缓慢漂移。

将样本平整放入ATR检测窗表面。每个样本的上下2 个表面分别采集3 次THz光谱数据，共获得6 份THz光谱数据，将其算术平均，作为该样本的最终THz光谱数据。因为THz光谱仪对温度和湿度比较敏感，所以光谱采集时保持实验室内温度、湿度基本一致。为避免空气中水汽以及被测物质散发出的水汽对检测光路的干扰，检测过程中始终用气泵向THz检测仓中注入干燥空气。

1.3.3 K值测定

采集完样本THz光谱数据后立即采用HPLC方法对其进行K值测定。参考汤水粉等[16]的测定方法，利用流动相中三磷酸腺苷分解的关联产物二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤在固定相中流速的不同，将这6 种化学组分分离，分别测其含量，根据公式（1）计算被测样本的K值[16,19]。

式中：HxR为次黄嘌呤核苷含量/（μmol/g）；Hx为次黄嘌呤含量/（μmol/g）；ATP为三磷酸腺苷含量/（μmol/g）；ADP为二磷酸腺苷含量/（μmol/g）；AMP为腺苷酸含量/（μmol/g）；IMP为肌苷酸含量/（μmol/g）。

1.3.4 光谱预处理

受背景等环境因素的影响和仪器性能的制约，采集到的光谱信号存在各种失真及噪声信息，影响模型的预测效果。因此在建模前需要对光谱信号进行预处理，多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、标准正态变量变换（standard normal variation transformation，SNVT）和导数处理是常用的方法，其中导数处理包括一阶微分（first derivative，FD）和二阶微分（second derivative，SD）。

MSC方法假定THz波的散射对每个样本、每个波点产生的影响是线性的，即假设每一条光谱都与“理想光谱”（没有散射误差效应的光谱）在全波长范围内存在线性关系，而真正的“理想光谱”无法得到，可以用样本集的平均光谱来近似。通过将样本集光谱与理想光谱线性回归，将光谱中的无用散射信号与样本有效成分的光谱吸收信息分离，消除由光散射产生的线性基线和光谱的不重复性[20-21]。

SNVT方法也是用来校正因散射而引起的光谱误差[22]。假定每一个光谱中，各波长点的吸光度满足正态分布，按照这一假设对每一条光谱进行预处理，使其尽可能接近“理想光谱”。SNVT和MSC被证明是线性相关的[23]，两者的区别是：MSC分别对每一个波长的光谱进行预处理，而SNVT分别对每一条光谱进行预处理。

导数处理可以消除基线漂移和其他背景的干扰、强化谱带特征、分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度，使得与新鲜度密切相关的光谱特性变得更为显著[24-25]。FD可以去除同波长无关的漂移，即全波长范围内的固定漂移；SD可以去除同波长线性相关的漂移。在求导过程中，差分宽度选择十分重要：宽度太小，噪声会很大，影响所建模型质量；宽度太大，噪声减少但是会失去大量的细节信息[26]。由于导数计算会增加噪声，故导数预处理之后采用Savitzky-Golay（SG）多项式平滑光谱。

1.3.5 光谱预测模型

建立回归数学模型的方法有线性和非线性算法。猪肉中的生物分子种类繁多，在常温条件下各种分子的特征谱具有重叠性，导致THz光谱并不仅表达K值的变化信息，而且是猪肉的所有化学成分复杂变化的综合信息。因此，非线性模型比线性模型更适合解释THz光谱与K值的复杂关系。本实验选用一种常用非线性算法反向传播人工神经网络（back propagation-artificial neural network，BP-ANN）建立回归模型。

BP-ANN能够模仿延伸人脑的认知功能，探索并构建出输入信号和输出信号之间的复杂联系，一般使用多层前馈神经网络。本实验使用的神经网络拓扑结构分为3 层：输入层、单隐含层和输出层。网络的输入是猪肉K值的THz光谱数据，网络的输出是一个节点即预测K值，隐含层和输出层的传递函数分别是“logsig”（S型对数函数）和“tansig”（双曲正切S型传递函数），它们都是非线性函数。单隐含层的节点数由经验公式（2）得出[27]：

式中：m为隐含层节点数；n为输入层节点数；l为输出层节点数；a为1～10范围内的常数。

评价模型质量用校正集相关系数（Rc）、校正集均方根误差（root mean squared error of calibration set，RMSEC）、预测集相关系数（Rp）和预测集均方根误差（root mean squared error of prediction set，RMSEP）等指标衡量[28]。相关系数Rc和Rp越大，RMSEC和RMSEP越小，模型的预测能力越好。本实验使用Matlab R2009b（Mathworks公司，美国）软件对光谱数据进行计算与建模。该软件执行效率高，包括模型参数优选在内的建模过程在1 min内就能完成，而各种光谱预处理算法以及光谱模型的K值预测均在1 s内完成。

2 结果与分析

2.1 样本K值测定结果

表1 采用HPLC法测定样本K值的统计结果Table1 Statistical results of K values of pork samples measured by HPLC

如表1所示，共获得80 个肉样的光谱数据和K值，K值范围涵盖了新鲜、次新鲜和变质的猪肉样本，选用的样本具有代表性。样本被随机分为54 个校正集和26 个预测集，个数比大致为2∶1；其中校正集用于建立THz光谱预测K值的数学模型，预测集用来检验模型预测未知样本K值的准确性。校正集、预测集和样本总集合的K值范围基本相同，平均值和标准差没有明显区别，因此校正集和预测集的样本分割是合适的。

2.2 K值预测模型的建立

图2 80 个样本的THz光谱原始谱线Fig.2 Raw THz spectra of 80 samples

由图2可以看出，不同猪肉样本的原始光谱强度有很大差异。光谱的差异不仅包含了样本成分的差异，还包括测量误差、基线漂移和背景噪声。为消除干扰信息，除尽可能保持实验环境因素一致外，还需对光谱数据进行预处理，以减弱或去除各种干扰因素，增强样本的有效信息在光谱中的表达，改善预测效果。光谱中未见有明显的吸收峰或者特征波段，可能一方面是因为猪肉尤其是瘦肉组织富含70%～80%的水，而水分子因其集体平移导致其对THz波无特征吸收[29]，从而使猪肉的THz谱线无特征吸收峰；另一方面是因为猪肉成分十分复杂，生物大分子如氨基酸[30]、多肽[31]、DNA[32]等以及生物小分子如核苷酸[33]等都会对THz波有吸收，导致各物质的吸收谱线相互重叠，无法在猪肉的THz光谱中分辨出特征峰。

通过THz光谱数据和猪肉K值的BP-ANN回归模型，比较研究用原始光谱以及用SNVT、MSC、FD和SD等预处理的光谱所建模型的预测性能，从而选择适合预测K值的光谱预处理方法。

训练神经网络前，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）对光谱信息进行压缩，用少数几个主成分的得分近似反映原光谱数据，以消除光谱数据点的信息冗余，防止训练后的神经网络过度拟合校正集数据，对预测集样本的预测能力差[34]。取累计贡献率达到95%的主成分集合作为神经网络的输入。PCA压缩后的光谱被归一化至-1～1范围内，实测K值被归一化至0～1范围内；采用留一交叉验证法选取隐含层节点数，即选取交互验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）值最小时的节点数[35]。

根据上述建模过程，可以获得原始和预处理后光谱的RMSECV值和隐含层节点数的关系图，如图3所示。因为FD和SD的差分宽度会影响预测模型的性能，所以FD和SD的最小RMSECV值还需要结合差分宽度选择。各预测模型的RMSECV最小值及其参数条件，如表2所示，用参数条件中最佳隐含层节点数构建BP-ANN，经校正集样本训练BP-ANN后获得各种预处理方法预测模型的性能，同时得到各预测模型的散点图，如图4所示。

图 3 RMSECV最小值的选择Fig.3 Selection of minimum value of RMSECV

表2 不同预处理方法预测模型的参数与性能Table2 Parameters and performances of the prediction models with different spectral pretreatments

图4 原始光谱与预处理后的光谱预测散点图Fig.4 Scatter plots with and without pretreatment

2.3 预测模型分析

从表2可以看出，未经预处理的原始光谱的校正集和预测集相关系数都很低，模型的预测精度差。如图4a所示，原始光谱预测模型中众多样本的预测值基本相同，约为60%，模型的预测性能很差；如图4b～e所示，预测结果有了明显提升。

MSC和SNVT预处理后模型预测性能提高有限，预测集的相关系数仅为0.5左右，属于弱相关。可能的原因是这2 种预处理方法校正因散射造成光谱误差，而THz波在ATR检测附件中基本以全反射模式传播，散射光较少，预处理校正作用有限。

FD和SD预处理能够削弱基线漂移，有效提升模型的预测性能。通过图2可以看出，THz原始光谱存在明显的基线漂移，经FD预处理后，模型预测集相关系数达到0.75，优于SD模型，可能的原因是光谱的基线漂移是定值漂移而不是同波长相关的线性漂移，所以FD预处理更适合。

FD和SD预处理还能够分辨重叠峰中的吸收峰，有效提升光谱的分辨率[36]。由于猪肉中的生物分子种类繁多，在常温条件下样本中各类物质的吸收峰相互混叠，导致图2吸收光谱中未见明显的吸收峰。但是新鲜度的差异会导致不同样本的THz吸收光谱出现微小差异，FD和SD预处理能放大这种差异，提升THz光谱与新鲜度的相关性。

导数预处理的差分宽度选择13（FD）或者7（SD）是合适的，宽度过小或者过大都会降低模型的预测性能。SG多项式平滑能够部分滤除测量本身的背景噪声和微分所产生的噪声。

综上所述，本法测定条件下，猪肉K值的BP-ANN预测模型较适合的THz光谱预处理方法是FD。此模型还有进一步完善的空间。样品成分复杂，吸收光谱中未见明显的吸收峰或者特征波段，可以优化组合光谱预处理方法，或者设计更优的预处理算法，滤除与新鲜度无关的物质对THz光谱的影响，从复杂成分的THz光谱中提取与K值相关度更大的特征波段，研究出更适合表达K值与THz光谱复杂非线性关系的模型，进一步提高预测精度。

此外，通过表2还可以看出，预处理算法使得每条光谱相邻波点的数据相关性增强，所以预处理后的光谱主成分数明显比原始光谱多。

3 结 论

为实现THz光谱无损检测猪肉K值，本实验在ATR检测模式下，比较研究原始光谱及在用SNVT、MSC、FD和SD等预处理后，BP-ANN预测模型的性能差异。结果表明FD预处理后模型的预测性能最优，相关系数Rp为0.75，RMESP为14.36%。可见，THz原始光谱中不仅包含新鲜度相关化学成分信息，还存在噪声和基线漂移，需要用预处理去除这些干扰，以提高模型的预测性能；不同的光谱预处理方法对模型的预测精度有不同的影响，FD预处理方法能够有效减弱光谱信号中的噪声和基线的固定漂移，放大与新鲜度相关的THz光谱微小差异，提升THz光谱与新鲜度的相关性。该研究为光谱预处理技术能够提高THz无损检测肉样新鲜度的精度提供了理论和实验依据，如进一步将光谱预处理方法进行优化组合，或者设计更优的预处理算法，将会进一步提高模型的预测性能。

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