鲍鱼肌肉多糖的性质及抗肿瘤活性

王军玲，魏配晓，邱绪建,2，翁武银,2,*

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.厦门市海洋功能食品重点实验室，福建 厦门 361021）

鲍鱼作为一种营养丰富的单壳类海洋生物，是传统的名贵食材，是海洋中氨基酸含量最全面，脂肪、胆固醇含量最低的生物之一，其肉味鲜美，鲜而不腻，清而味浓，位居“四大海味”之首，具有丰富的营养价值和药用价值，目前在亚洲地区被广泛养殖[1-2]。中国作为最大的鲍鱼出产国，2015年鲍鱼产量已经突破了12万 t[3]。为了进一步阐明鲍鱼的药用价值，有必要了解鲍鱼中生理活性物质的理化性质及其活性，为鲍鱼相关的功能性食品的开发提供理论参考。

多糖是鲍鱼中重要的生理活性物质之一。Li Guoyun等[4]从鲍鱼中提取了一种具有良好的抗凝血活性的糖胺聚糖，其单糖组成及比例为GlcA∶GalN∶Fuc∶Gal=2.14∶2.37∶2.94∶1。Zhu Beiwei等[5]从鲍鱼腹足中提取的中性多糖主要由1-、1,4-、1,6-、1,4,6-连接的葡萄糖以及1-、1,3-、1,6-、1,4,6-连接的半乳糖组成，但从鲍鱼性腺中提取的多糖是硫酸基多糖，主要由半乳糖、岩藻糖、鼠李糖组成，且表现出了良好的羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性[6]。Zhu Beiwei等[7]还从鲍鱼内脏中提取了一种能够诱导细胞分泌缩胆囊素释放的硫酸基多糖。由此可以看出，从鲍鱼不同部位提取的多糖具有不同的理化性质，同时会表现出不同的生物活性。鲍鱼肌肉作为鲍鱼的主要可食部位，多糖含量达到了鲍鱼（干）质量的9.23%[1]。但是，目前关于鲍鱼肌肉多糖（abalone muscle polysaccharide，AMP）理化性质的研究以及对人体乳腺癌细胞和肝癌细胞的抑制活性还鲜有报道。

皱纹盘鲍是我国所产鲍中个体最大者，为鲍类上品，不仅个大体肥，肉细味鲜，而且营养丰富，被称为“海味之冠”，是我国沿海鲍科最具经济价值的种类之一[8]。本研究通过蛋白酶酶解结合乙醇分级沉淀和DEAE-52柱层析分离获得AMP，对AMP及其分离组分的化学组成、单糖组成、紫外光谱、红外光谱、微观结构等理化性质进行测定，还分析了各组分对人体肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制活性，为鲍鱼功能性保健食品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲍鱼（Haliotis discus hannai Ino）由厦门市东月屿海洋食品有限公司提供，并于-20 ℃保存；胰酶（4 000 U/g）、胶原酶（300 000 U/g）、碱性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜酶（65 000 U/g） 南宁庞博生物技术有限公司；葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one，PMP） 美国Sigma公司；DEAE-52阴离子交换树脂 上海源叶生物科技有限公司；HepG2细胞、MDA-MB-231细胞 云南昆明细胞库；MTT细胞增殖检测试剂盒 北京索莱宝生物科技有限公司；100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素 美国Corning公司；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM） 江苏恩莫阿赛生物技术有限公司；胎牛血清 以色列BioInd公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-8000A型紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；1200型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 美国赛默飞世尔科技公司；Avanti J-25离心机 美国Beckman公司；Thermo Scientific Forma 702二氧化碳培养箱 美国Thermo公司；Series II Water Jaket 酶联免疫检测仪 美国BMG公司；S-4800扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1 鲍鱼肌肉粗多糖的制备

将鲍鱼肌肉与水按照1∶2（g/mL）混合后捣碎，室温静置30 min，5 000 r/min离心20 min后收集上清液。在获得的上清液中同时加入上清液体积0.5 g/100 mL的胰酶和胶原酶，在pH 8.5、50 ℃条件下酶解4 h，然后将酶解液的pH值调整至6.0，加入上清液体积0.5 g/100 mL的木瓜酶，在50 ℃继续酶解6 h。酶解液利用沸水浴灭活15 min，将离心（10 000 r/min，10 min）获得的上清液用体积分数40%的乙醇溶液进行沉淀，4 ℃静置12 h后5 000 r/min离心20 min，将上清液中乙醇体积分数调整至80%，4 ℃静置12 h后5 000 r/min离心20 min，收集沉淀。沉淀用蒸馏水溶解后加入1 g/100 mL的活性炭进行吸附脱色，40 ℃水浴锅中静置1 h后，10 000 r/min离心10 min去活性炭。获得的上清液经真空冷冻干燥后得到鲍鱼肌肉粗多糖。采用称质量法测定AMP得率，计算公式如式（1）所示：

1.3.2 粗多糖的分离纯化

AMP参照Li Shichao等[9]的方法利用DEAE-52阴离子交换柱进一步分离纯化。柱层析的条件：柱规格为400 mm×16 mm，上样质量浓度为15 mg/mL，上样体积为3 mL，流速为0.5 mL/min，流动相为0、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液，每管收集3 mL。采用苯酚-硫酸法于490 nm波长处隔管检测溶液的吸光度，收集各组分峰，经透析浓缩和乙醇沉淀，冷冻干燥后得鲍鱼肌肉粗多糖的各纯化组分。

1.3.3 化学组成分析

多糖的总糖含量用苯酚-硫酸法进行测定，以D-葡萄糖作为标准品[10]；蛋白含量用Lowry法进行测定，以牛血清蛋白为标准品[11]；糖醛酸含量用间羟基联苯法进行测定，以D-葡萄糖醛酸为标准品[12]；硫酸基含量用氯化钡-明胶比浊法进行测定，以K2SO4为标准品[13]。

1.3.4 紫外光谱分析

将鲍鱼肌肉粗多糖及其纯化组分分别用蒸馏水溶解，使其终质量浓度为0.5 mg/mL，以蒸馏水为空白对照，在190～400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，确定各多糖组分的特征吸收峰。

1.3.5 FTIR分析

取少量粉末样品置于Thermo Nicolet iS50 FTIR仪上进行扫描，扫描的波长范围为4 000～400 cm-1，光谱分辨率为4 cm-1，扫描次数为32 次。

1.3.6 单糖组成分析

单糖组成分析采用柱前衍生-高效液相色谱法[14]。将2 mg样品置于具塞试管中，加入1 mL三氟乙酸溶液（2 mol/L）后在氮气的保护下于110 ℃油浴锅中水解6 h。水解液加入5 mL甲醇，在55 ℃旋干，重复3 次，最后用500 μL蒸馏水洗出。取100 μL标准品混合液或样品水解液加入100 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液和120 μL的0.5 mol/L的PMP溶液，混匀后在70 ℃水浴锅中避光衍生1 h，室温加入100 μL的0.3 mol/L的HCl溶液终止反应。衍生后的溶液中加入500 μL的氯仿萃取3 次，水相过0.22 μm的滤膜后取20 μL进行高效液相色谱分析。色谱条件：色谱柱为Atlantis®dC18column（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温为25 ℃，流动相为pH 6.7的磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L）-乙腈（83∶17，V/V），流速为0.5 mL/min，检测波长为245 nm，单糖标准品为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖。

1.3.7 碘液显色分析

AMP-1的碘液显色分析按照宋根萍等[15]的方法进行，并稍作修改。将0.05 g淀粉和AMP-1分别溶于10 mL蒸馏水中，滴入数滴碘滴定液，混匀后观察溶液的颜色变化。

1.3.8 SEM观察

各多糖组分的表面形态采用SEM进行观察。测定前，利用装有硅胶的干燥器对各多糖组分抽真空干燥1 周以上，使其充分干燥。将干燥后的多糖样品分别固定在样品台上，表面镀金后利用SEM进行观察，电子束的加速电压为5 kV。

1.3.9 AMP及其分离组分对人类肿瘤细胞系抑制率的影响

HepG2细胞和MDA-MB-231细胞用含有10%胎牛血清、1%双抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）的DMEM培养液于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。HepG2细胞和MDA-MB-231细胞存活率参考Oh等[16]报道的方法进行测定。细胞以5×104/孔密度接种于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，培养液中加入不同浓度的多糖各组分继续孵育48 h。培养结束后，弃去培养液，最后采用MTT法检测细胞活性，每组样品测定3 个平行，细胞存活率按式（2）计算：

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 17.0软件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）对所得数据进行ANOVA方差分析，显著性检验方法为Duncan多重检验，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 多糖的分离

经蛋白酶酶解结合乙醇分级沉淀的方法从鲍鱼肌肉中提取的AMP得率为0.9%（以干质量计算），粗多糖的总糖质量分数达到了83.9%。由图1可以看出，经DEAE-52阴离子交换柱层析分离后，用 0、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液洗脱后分别得到了AMP-1、AMP-2、AMP-3三个多糖组分，进一步提高NaCl浓度至1.0 mol/L时没有多糖被洗脱下来，收集的3 个多糖组分对应的得率分别为63.0%、8.6%和6.1%。AMP-1、AMP-2和AMP-3均为白色的粉末。

图1 AMP的DEAE-52柱层析梯度洗脱曲线Fig.1 Stepwise elution curve of AMP on DEAE-52 cellulose column

2.2 化学组成分析结果

由表1可以看出，AMP总糖质量分数达到了83.9%，明显高于张月红等[1]利用热水提取法从鲍鱼肌肉中提取的多糖（74.9%）；本研究提取的AMP中蛋白质量分数仅为3.6%，表明蛋白酶解结合乙醇分级沉淀法提取多糖时可以除去大部分蛋白；AMP中仅含有少量的糖醛酸和硫酸基，表明AMP主要由中性多糖组成。

AMP经DEAE-52柱层析分离后，随着NaCl浓度的增加，所得组分中的多糖含量逐渐降低，而硫酸基和糖醛酸的含量却逐渐增加（表1）。这是由于DEAE-52是阴离子交换柱，样品中带负电的离子不容易被洗脱下来的缘故。表1还表明，分离得到的AMP-1中的蛋白、硫酸基、糖醛酸含量均很低，是一种中性多糖，而AMP-2和AMP-3可能是糖蛋白，并含有一定量的糖醛酸和硫酸基。

表1 AMP及其分离组分的化学组成Table1 Chemical composition of AMP and its fractions%

2.3 单糖组成分析结果

由图2可以看出，各单糖标准品经PMP衍生化后可以很好地分离。鲍鱼肌肉粗多糖主要由葡萄糖组成，其含量达到92.6%。然而，目前报道的AMP其单糖组成都比较复杂。Li Guoyun等[4]利用木瓜蛋白酶酶解结合十六烷基吡啶鎓溶液和乙醇沉淀的方法从青岛的鲍鱼腹足中提取的糖胺聚糖主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、半乳糖和岩藻糖组成，而Zhu Beiwei等[5]利用木瓜蛋白酶酶解结合乙醇沉淀的方法从大连的鲍鱼腹足中提取的中性多糖主要由葡萄糖和半乳糖组成。这些结果均不同于本实验提取的AMP，这可能与鲍鱼的产地、饲养条件以及多糖的提取方法有关。化学组成（表1）及单糖组成（图2）的结果表明AMP是一种的新型AMP。

粗多糖AMP经DEAE-52柱层析分离后，AMP-1中的葡萄糖含量进一步增加，达到了99.3%，表明AMP-1是一种葡聚糖。这与Li Xia等[17]从扁玉螺中提取的多糖（98.3%）以及Qiao Deliang等[18]从三角帆蚌中提取的多糖（97.9%）类似，这可能与肌肉中的多糖主要以糖原的形式存在有关。与AMP-1相比，AMP-2和AMP-3的单糖组成比较复杂，AMP-2主要由葡萄糖、半乳糖和氨基葡萄糖组成，其对应的比例依次为61.2∶14.3∶9.1，达到了总糖含量的84.6%。AMP-3主要由葡萄糖、半乳糖和氨基半乳糖组成，对应的比例依次为33.4∶20.1∶10.7，达到了总糖含量的64.2%。Li Guoyun等[4]从鲍鱼腹足中提取的多糖同样含有较高含量的半乳糖和氨基半乳糖，其单糖组成及物质的量比例依次为葡萄糖醛酸∶氨基半乳糖∶岩藻糖∶半乳糖=2.14∶2.37∶2.94∶1，但这与本实验所提取的多糖的单糖组成仍然存在很大的差异，这可能与多糖的提取方法以及鲍鱼的来源不同有关[19]。

图2 AMP及其分离组分的单糖组成Fig.2 Monosaccharide composition of AMP and its fractions

2.4 碘液显色分析

单糖组成的测定结果表明AMP-1是一种葡聚糖，所以通过碘液显色反应来判断其是否具有普通淀粉的性质，结果如图3所示。AMP-1与碘液反应没有出现蓝色显色反应，逐渐增加碘液用量也未出现蓝色，但在同样实验条件下淀粉呈现明显的蓝色，表明AMP-1不是常见的淀粉[15]，由此证明AMP-1是一种非淀粉的葡聚糖。

图3 AMP-1的碘液显色图片Fig.3 Iodine staining picture of AMP-1

2.5 紫外光谱结果分析

图4 AMP及其分离组分的紫外扫描图谱Fig.4 UV spectra of AMP and its isolated fractions

由图4可以看出，AMP及其分离组分在190～200 nm范围内均出现了多糖的特征吸收峰，但是在相同的质量浓度下，随着多糖样品中蛋白含量的增加（表1），样品在190～200 nm范围内的紫外吸收逐渐增强，且最大吸收波长会发生红移，这是因为200 nm附近不仅是糖的特征吸收，也可能是肽键的特征吸收，而且在195 nm附近蛋白的紫外吸收强于多糖[20-22]。除此之外，AMP-2和AMP-3在280 nm附近都出现了明显的吸收峰，这有可能是酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸与多糖之间的共价结合导致的。

2.6 FTIR结果分析

如图5所示，AMP在3 355 cm-1处的强吸收峰是O—H的伸缩振动峰，2 938 cm-1和1 416 cm-1处的吸收峰分别是C—H的伸缩振动峰和变角振动峰[9]，1 026～1 135 cm-1范围内的强吸收峰是C—O—C和C—O—H的伸缩振动峰，这几组峰是多糖的特征吸收峰。1 668 cm-1处的吸收峰属于C＝O的伸缩振动峰，而1 731 cm-1处的吸收峰属于羧基的特征吸收峰，由图5A可以看出，AMP中在1 731 cm-1处仅有一个很弱的吸收峰，表明AMP中仅含有少量的糖醛酸。与AMP相比，AMP-1在1 731 cm-1附近没有出现吸收峰，而AMP-2和AMP-3在此处都具有明显的吸收峰，这与表1中糖醛酸含量的测定结果一致。另外，与AMP相比，AMP-2和AMP-3在3 600～3 200 cm-1波数范围内的吸收峰发生了明显的蓝移，这可能是因为AMP-2和AMP-3中含有较高的蛋白质和氨基糖，N—H的伸缩振动峰也在这个范围内，但N—H的伸缩振动峰低于O—H的伸缩振动峰导致的[23]。AMP-2和AMP-3分别在1 546 cm-1和1 544 cm-1波数处出现了明显的N—H的变角振动吸收峰。AMP-3在1 223 cm-1处的吸收峰是＞S＝O的伸缩振动峰，由于其他组分中硫酸基含量较低，所以只有AMP-3在此处出现了明显的吸收峰。值得注意的是，AMP和AMP-1分别在842 cm-1和853 cm-1处有一个明显的吸收峰，表明AMP-1是一种α构型的吡喃糖[24-25]，而AMP-1是AMP的主要组分，所以AMP在此处也出现了α-糖苷键的吸收峰。

图5 AMP及其分离组分的傅里叶红外图谱Fig.5 FT-IR spectra of AMP and its isolated fractions

2.7 SEM观察结果分析

图 6 AMP及其分离组分的SEM图Fig.6 SEM spectra of AMP and its isolated fractions

如图6所示，在放大500 倍时，AMP和AMP-1呈现类似于片状的结构，且AMP-1更加紧密、光滑，这个片状结构类似于Xie Jianhua等[26]从青钱柳叶中提取的多糖，而AMP-2和AMP-3呈现不规则的团块状。在放大20 000 倍时，与AMP相比，AMP-1的表面更加简洁和光滑，而AMP-2和AMP-3中可以观察到不同规格的球型颗粒状。据文献报道，多糖经硫酸化以后会出现多相卷积结构，而单糖组成、分子间的相互作用力等都会影响到多糖的表面形态[26-28]，所以AMP-2和AMP-3的球状结构可能与多糖分子中含有的硫酸基、复杂的单糖组成以及多糖分子间的相互作用力有关。

2.8 AMP及其分离组分对人类肿瘤细胞系抑制率的影响

图7显示了AMP及其纯化组分对人体肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制率的影响。由图7a可以看出，当样品质量浓度为1 mg/mL时，AMP对MDA-MB-231细胞的抑制率为16.9%，低于程婷婷等[29]从鲍鱼脏器中提取的多糖在800 μg/mL时对HeLa细胞（18.54%）的抑制率，但高于多糖在800 μg/mL时对K562细胞（11.6%）的抑制率。而AMP-1、AMP-2、AMP-3在1 mg/mL时对MDA-MB-231细胞的抑制率分别为25.9%、0.7%、-8.5%。随着培养液中多糖质量浓度的增加，AMP和AMP-1对MDA-MB-231细胞的抑制率成上升趋势，当多糖质量浓度为8 mg/mL时，抑制率分别达到了66.5%和71.6%。但是，AMP-2和AMP-3在1～4 mg/mL范围内对MDA-MB-231细胞均没有表现出抑制活性，甚至对细胞生长有轻微的促进作用，AMP-2和AMP-3在8 mg/mL时对细胞的抑制率分别为25.8%和29.2%。He Rongjun等[30]从Edwardsia sipunculoides中提取的多糖对Du145癌细胞也表现出了低浓度促进，高浓度抑制的现象。各组分之间不同的抗肿瘤活性可能与测定的多糖、蛋白的含量以及单糖组成有关。

图7 AMP及其分离组分对人体乳腺癌细胞MDA-MB-231（a）和肝癌细胞HepG2（b）抑制率的影响Fig.7 Inhibitory effects of AMP and its isolated fractions on human breast cancer MDA-MB-231 cells (a) and human liver cancer HepG2 cells (b)

由图7b可以看出，随着培养液中样品质量浓度的增加，AMP和AMP-1对HepG2细胞的抑制率呈上升趋势，当样品质量浓度为8 mg/mL时，抑制率分别达到了72.6%和72.5%。但是，在1～8 mg/mL的质量浓度范围内，AMP-2对HepG2细胞均未表现出明显的抑制活性，且随着样品质量浓度的增加对细胞的促进作用呈上升趋势，AMP-3对细胞的抑制率也没有显著影响。Wu Yiqian等[19]的研究也发现，鲍鱼多糖的不同组分对HepG2细胞具有不同的作用，这可能与多糖组分的单糖组成有关。

AMP-1对两种癌细胞都具有良好的抑制效果，根据化学组成、单糖组成、紫外光谱以及红外光谱的结果可以发现，AMP-1的生物活性可能与多糖的纯度、单糖组成、糖苷键的构型等有关，但是它的结构特征对肿瘤细胞的抑制机制还有待进一步的研究。

3 结 论

鲍鱼肌肉粗多糖主要由中性糖组成。AMP-1是一种葡聚糖，其构型为α-吡喃糖，AMP-2和AMP-3含有较高的蛋白和少量的酸性基团，可能是糖蛋白。AMP和AMP-1对人体肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231均表现出了良好的抑制活性，这个结果表明AMP可以为抗肿瘤相关的功能性食品的开发提供一种新的选择。

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