发酵时间对馒头品质及面筋蛋白结构的影响

韩红超，李文钊*，周 航，于 磊，姜化彬，崔文进，阮美娟

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

小麦馒头是中国的传统主食之一，在饮食文化中占有重要地位。发酵是馒头生产中非常关键的环节，它与馒头的品质有直接的关系，因此发酵方面的研究深受人们重视[1]。发酵中产生的CO2和其他一些气体使面团持气，形成多孔结构，馒头膨胀，体积增大，蒸制后馒头松软而有弹性[2]。面团发酵时间不同，酵母产气量不同，面筋蛋白网络结构的伸展性也大不相同[3]。

小麦粉中含9%～14%的蛋白质，包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白[4-5]。小麦面筋蛋白包括醇溶蛋白与麦谷蛋白，其中醇溶蛋白占小麦蛋白的40%～50%，麦谷蛋白占30%～40%。醇溶蛋白分子质量较小（约30～75 kDa），无亚基结构，由范德华力、分子间氢键、分子内二硫键及疏水键连结成单肽[6]。醇溶蛋白是球状分子，表面积小，分子间作用力不强，决定了小麦面团的黏性与延伸性[7]。麦谷蛋白为纤维状分子，含17～20 个多肽亚基，可分为高分子质量谷蛋白亚基和低分子质量谷蛋白亚基，分别占总量的10%和90%。谷蛋白亚基的N-末端重复区域存在大量的β-转角结构，形成规则的螺旋结构，具有刚性。而非重复的C-末端区域富含α-螺旋结构，形成紧凑的结构[8-13]。

红外光谱在研究分子中化学键或官能团种类方面被广泛应用，傅里叶变换红外光谱更是有重要应用[14-15]。戈志成[16]利用傅里叶变换红外光谱探究湿热-琥珀酸酐酰化改性谷朊粉的结构变化，发现琥珀酸酐处理会使部分β-转角转化为β-折叠结构，且α-螺旋结构减少。王金水[17]发现酶解-膜超滤改性后面筋蛋白结构明显改变，β-折叠增加，α-螺旋/β-折叠比值下降，接枝物种α-螺旋/β-折叠比值最低。发酵是馒头制作中很关键的步骤，目前国内外对馒头发酵剂的研究较多，关于发酵条件与馒头面筋蛋白二级结构的关系鲜见报道，本实验利用体积仪、质构仪、傅里叶变换红外光谱仪对馒头品质与面筋蛋白二级结构进行测定，探究馒头宏观品质与面筋蛋白微观结构之间的关系，为馒头的新品研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

安琪酵母 市售；小麦粉 新疆佳宏集团有限公司。

氢氧化钠（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醇（分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；溴化钾（分析纯） 寿光昊翔化工有限公司。

1.2 仪器与设备

IS50FT-IR傅里叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技有限公司；CF-3500发酵箱 中山卡士电器有限公司；HM740和面机 青岛汉尚电器有限公司；BVM6630体积测定仪 瑞典波通公司；TA.XT. Plus质构仪 英国Stable Micro System公司；TGL-16A高速冷冻离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；Vizared 2.0型真空冷冻干燥机 美国VirTris公司。

1.3 方法

1.3.1 馒头的制作

配方：小麦粉（100%）、水（依据小麦粉吸水率）、酵母（1%）。

制作方法：将小麦粉、水、酵母放入和面机中，和面10 min，在温度35 ℃，相对湿度70%的醒发箱中分别发酵60、70、80、90、100 min。取出发酵面团切成70 g的剂子，快速成型，在温度35 ℃、相对湿度70%的醒发箱中醒发20 min后，放入锅内，水沸后计时蒸制20 min，取出馒头冷却30 min待测。

1.3.2 馒头比容测定

使用BVM6630体积测定仪对馒头进行测定。先开机预热20 min，然后将冷却后的小麦馒头放入体积仪样品测定区，设置仪器参数进行样品测定，并记录比容值，每个样品测1 次，取6 个样品的平均值。

1.3.3 馒头质构测定

质构测试前将馒头平放，用刀将馒头从中间部位自上而下垂直切成均匀的两部分，再分别切出表面平整的体积为2 cm×2 cm×2 cm的样品。

使用TA.XT.Plus质构仪，选用TPA模式，P36R探头对成品馒头进行质构测定。每个样品测定6 次取平均值，得到硬度、弹性、黏聚性、胶着度、咀嚼度、回复性指标。

质构测定参数：测试前速率1.0 mm/s；测试中速率1.0 mm/s；测试后速率1.0 mm/s；压缩比50%；2 次压缩间隔5 s。

1.3.4 馒头脱脂处理

采用Macritchie等[18]的脱脂方法稍加修改。将小麦馒头块与三氯甲烷以1∶2（m/m）混合，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，然后抽滤，重复3 次本操作。将抽滤后的馒头块放于通风橱中，晾干后待用。

1.3.5 面筋蛋白的提取

1.3.5.1 醇溶蛋白的提取

参考Osborne[19]的方法稍加修改，将100 g脱脂馒头加入1 000 mL 70%乙醇溶液，室温条件下磁力搅拌6 h，7 000 r/min离心15 min取上清液，调节pH值到8（蛋白质等电点），取上清液在黑暗条件下静置1 h后，7 000 r/min离心30 min取沉淀（醇溶蛋白），蒸馏水洗3 次，蛋白冻干后备用。

1.3.5.2 麦谷蛋白的提取

参考Osborne[19]的方法稍加修改，将100 g脱脂馒头加入1 000 mL蒸馏水溶液并调节pH值到8.5，室温条件下磁力搅拌6 h，7 000 r/min离心20 min取上清液，调节pH值到等电点，在黑暗条件下静置1 h后，7 000 r/min离心40 min取沉淀（麦谷蛋白），蒸馏水洗3 次，蛋白冻干后备用。

1.3.6 红外光谱检测

1 mg冻干样品与150 mg KBr混合均匀，迅速研磨成粉，压片。红外光谱在Nicolet iS50 FT-IR傅里叶变换红外光谱仪上扫描测定，扫描波段4 000～400 cm-1，扫描次数16，分辨率为4 cm-1。

醇溶蛋白光谱和麦谷蛋白傅里叶变换红外光谱进行基线校正、纵坐标归一化，在酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）区域内进行7 点平滑，获得二阶导数谱，并设置去卷积参数：醇溶蛋白半峰宽为47.5，增强因子为3.0；麦谷蛋白半峰宽为45.5，增强因子为3.1，用高斯/洛伦茨拟合，再用二阶导数拟合，多次拟合使残差最小。根据峰面积计算各二级结构的比率。

1.4 数据处理

采用Excel 2016软件进行数据处理和分析，SPSS 18.0软件进行实验数据的差异性分析，傅里叶变换红外光谱自备Omnic 5.0软件对红外数据进行处理，Origin 9.0软件绘制图像。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对馒头比容的影响

图1 发酵时间对馒头比容的影响Fig.1 Effect of fermentation time on specif i c volume of steamed bread

从图1可以看出，随着发酵时间的延长，馒头比容呈先上升后下降的趋势，在发酵时间为90 min时达到最大值，这可能是因为发酵时间延长，面筋蛋白中形成的二硫键增加，面筋蛋白网络结构伸展，面团持气性好，但随着发酵时间的继续延长，面团产气增多，超过了面筋网络结构的延伸限度，造成塌陷，比容降低。

2.2 发酵时间对馒头质构特性的影响

表1 发酵时间对馒头质构特性的影响Table1 Effect of fermentation time on texture characteristics of steamed bread

由表1可知，随着发酵时间的延长，馒头的硬度、胶着度、咀嚼度逐渐降低，而弹性、黏聚性、回复性逐渐上升。硬度是质构仪第1次压缩时的峰值，是评价馒头质地非常重要的指标[20]，当发酵时间增加到80 min后，硬度降低的速度变缓慢，这时蛋白质伸展变缓慢，面筋网络结构形成变慢。弹性表示样品第1次被压缩后的再恢复程度，发酵时间越长，弹性越大，可能是由于发酵时间越长，面筋蛋白网络结构越稳定，压缩时不易被破坏。黏聚性表示样品经过第1次压缩变形后所表现出来的对第2次压缩的相对抵抗能力，指的是形成样品形态所需内部结合力的大小，反映了样品内部分子间或各结构要素间的结合作用的强弱，因此，也反映了样品抵抗受损、保持自身完整性的能力，随着发酵时间的延长，黏聚性呈上升趋势，说明发酵时间越长，馒头内部结合力越大，面筋网络中氢键、二硫键的数量可能越多。

2.3 发酵时间对小麦馒头醇溶蛋白二级结构的影响

采用高斯/洛伦茨函数拟合和二阶导数处理的傅里叶变换红外光谱酰胺I带（Amide I，1 600～1 700 cm-1）归属方法[21]研究发酵时间对小麦馒头醇溶蛋白二级结构的影响。图2为不同发酵时间制作馒头中醇溶蛋白的傅里叶变换红外光谱酰胺I带，经去卷积、二阶导数处理后，酰胺I带中的各子峰的结构归属见表2。

图2 不同发酵时间馒头醇溶蛋白的红外光谱去卷积酰胺I带图谱Fig.2 Amide I bands in FTIR spectrum of gliadin as a function fermentation time

表2 不同发酵时间馒头醇溶蛋白二级结构及相对含量Table2 Secondary structure composition of gliadin as a function of fermentation time

由表2可以看出，波数为1 617、1 628、1 685、1 695 cm-1处的吸收峰，在发酵时间延长到80 min时均发生蓝移。根据各子峰占总峰面积之比为该结构相对含量计算得到不同发酵时间条件下馒头中醇溶蛋白各二级结构的相对含量。从各结构的相对含量来看，随着发酵时间的延长，β-折叠、α-螺旋相对含量无显著变化，无规则卷曲逐渐减少，而β-转角则逐渐增加。β-转角是一种非重复性结构，是由β-转角中第1个残基的C＝O与第4个残基的N—H氢键键合形成一个紧密的环，β-转角是较为稳定的结构[22]。随着发酵时间的延长，β-转角相对含量增加的原因可能是馒头的醇溶蛋白中无规则卷曲转化为β-转角所致，这种转化使醇溶蛋白结构更加稳定[23]。

图3 不同发酵时间馒头醇溶蛋白的红外羟基吸收带Fig.3 Intensity of hydroxyl absorption band in FTIR spectrum of gliadin as a function of fermentation time

羟基在红外光谱2 800～3 800 cm-1波段有伸缩振动吸收，可以用来表征样品的水合情况。羟基带强度越大表示样品的水合作用越强，也就表明样品的亲水能力越强[24]。从图3可以看出，随着发酵时间的延长，羟基吸收带逐渐增强，表明发酵时间越长，醇溶蛋白的水合作用越强，这可能是由于发酵时间越长，水分活度增加，更多的亲水基团暴露出来[25]。

2.4 发酵时间对小麦馒头麦谷蛋白二级结构的影响

图4 不同发酵时间馒头麦谷蛋白傅里叶变换红外图谱（A）和1 500～1 000 cm－1波段红外图谱（B）Fig.4 FTIR spectra in the wavenumber between 1 500 and 1 000 cm-1 of glutenin as a function of fermentation time

从图4 A可以看出，随着发酵时间的延长，3 500～3 300 cm-1波段的宽吸收峰强度明显下降，表明蛋白质结合水中的O—H基团与氨基酸中的C＝O所形成的分子内或分子间的氢键减弱，或者O—H伸缩振动、N—H伸缩振动减弱[26]。酰胺I带（1 700～1 600 cm-1）吸收峰有明显变化，该峰对蛋白质二级结构变化相当敏感，该处归属C＝O伸缩振动[27]。图4A中3 800～2 800 cm-1波段羟基伸缩光谱中可以得出，随着发酵时间的延长，麦谷蛋白羟基带强度逐渐减弱，水合作用减弱，可能是亲水基团遭到破坏或者相邻亲水基团连结在一起造成的。如图4B所示，当发酵时间延长到80 min时，位于1 082 cm-1与1 155 cm-1处的峰消失，说明发酵时间的延长可使P＝O或P—O—C对称伸缩振动以及蛋白质环状结构的C—C振动或者C—O—O糖苷键振动减弱[28]。

表3 不同发酵时间条件下馒头中麦谷蛋白二级结构及相对含量Table3 Secondary structure composition of glutenin as a function of fermentation time

从表3可以看出，α-螺旋与无规则卷曲相对含量变化不大，β-折叠相对含量先上升后下降，而β-转角相对含量则是先下降后上升。这可能是β-折叠与β-转角的相互转化。当发酵时间从60 min增加到80 min时，酵母产气，面团膨胀，蛋白质伸展破坏了多肽链的反转，使相邻肽链的N—H和C＝O之间形成有规则的氢键即β-折叠结构，使蛋白质的二级结构更加稳定。当发酵时间超过80 min后，氢键遭到破坏或者氨基酸被破坏，多肽链反转，形成β-转角[29]。

2.5 馒头宏观指标与微观指标相关性分析

表4 馒头质构各指标、醇溶蛋白酰胺I带各二级结构相对含量相关性分析Table4 Correlation analysis between texture properties and secondary structure components (curve- fi tting amide I band) of gliadin in steamed bread

为探究馒头宏观指标与微观指标之间的关系，将质构各指标、醇溶蛋白酰胺I带各二级结构相对含量进行相关性分析。利用SPSS 19.0进行相关性分析的双侧检验[30]，分析结果见表4。醇溶蛋白酰胺I带无规则卷曲相对含量与质构中的弹性、咀嚼度显著相关；无规则卷曲相对含量与质构中的胶着度、回复性极显著相关。醇溶蛋白酰胺I带β-转角相对含量与质构中的硬度、胶着度显著相关；β-转角相对含量与弹性、黏聚性、咀嚼度有极显著相关性。

3 结 论

随着发酵时间的延长，馒头比容先上升后下降，在发酵时间为90 min时比容最大；馒头的硬度、胶着度、咀嚼度逐渐降低，而弹性、黏聚性、回复性逐渐上升。馒头中醇溶蛋白与麦谷蛋白中β-折叠相对含量均为最高。随着发酵时间的不断延长，醇溶蛋白中β-折叠、α-螺旋相对含量没有显著性变化，无规则卷曲逐渐减少，而β-转角则逐渐增加；羟基吸收带逐渐增强，醇溶蛋白的水合作用越强。麦谷蛋白中α-螺旋与无规则卷曲相对含量变化不大，β-折叠呈先上升后下降的趋势，而β-转角则是先下降后上升；羟基带强度逐渐减弱；当发酵时间延长到80 min时，麦谷蛋白红外光谱位于1 082 cm-1与1 155 cm-1处的峰消失不见。从馒头质构各指标与醇溶蛋白各二级结构相对含量相关性可以看出，宏观指标与微观指标之间存在一定的关系，随着发酵时间的延长，醇溶蛋白二级结构中无规则卷曲向β-转角转化，结构趋向稳定有序，不易被破坏，致使馒头弹性、黏聚性升高。发酵时间越长，醇溶蛋白水合作用越强，醇溶蛋白结合水分子后氢键增加，蛋白伸展，致使馒头比容上升、硬度降低。馒头宏观品质与面筋蛋白微观结构确实相互联系，这为以后馒头新品研发、稳定性研究提供理论依据。

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