正交实验法优选益肾涤浊丸的制备工艺

1．广东省肇庆市中医院，广东 肇庆 526060；2．广东药科大学，广东 广州 510006；3.广东省化妆品工程技术研究中心，广东 中山 528458

益肾涤浊丸是广东省名老中医梁宏正临证多年的经验方，具有清热解毒、通癃涤浊、祛瘀止痛、益肾补虚，主治急、慢性前列腺炎、性功能障碍等症，在广东省肇庆市中医院临床应用多年，疗效良好。方中黄柏有较好的清热燥湿泻火作用，《医学启源》引用《主治秘诀》云:“泻膀胱龙火，利结小便，下焦湿肿，脐中痛，补肾水不足”[1]。其主要有效成分为小檗碱，小檗碱有较好的抗菌、抗炎等药理作用。丸剂的溶散时限已作为评价丸剂内在品质的重要手段之一，是对丸剂特有的检查项目。因此本实验以小檗碱含量和溶散时限为考察指标，用L9(34)正交试验法[2]优化益肾涤浊丸的制备工艺，可以较为全面的衡量工艺的合理性，得到疗效稳定、质量可控的制剂。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪(美国，Waters)，GZX-9246MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；B-220恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；BS-6G智能崩解试验仪(上海优浦科学仪器有限公司)；HWS26电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；BY-800型调速糖衣锅(长沙湘劲机械)；UV1000紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；CP225D万分之一天平(德国Sartorus公司)。

1.2 材料 盐酸小檗碱对照品(批号：100080-201409，中国食品药品检定研究院)；磷酸二氢钾(AR,天津市福晨化学试剂厂)；乙腈(色谱纯，天津市百世化工有限公司)；超纯水(屈臣氏)。所用药材经广东药科大学田素英副教授鉴定均符合2015版中国药典标准。

2 方法与结果

2.1 制丸和溶散时限的测定 将黄柏、苦参、虎杖、黄芪、淫羊藿、菟丝子6味药加8倍水(浸泡10 min)回流2次，每次1 h，滤过，合并滤液并浓缩成相对密度为1.15～1.20(20℃)的清膏[3]，备用；粉萆薢等中药粉碎过100目筛的药粉，备用。用调速糖衣锅喷洒少量水进行起模，加大成型时喷洒黏合剂，将丸粒制成黄豆粒大小，进行整粒，盖面，干燥即得[4]。按照2015年版《中国药典》(一部)丸剂溶散时限方法测定[5]。

2.2 盐酸小檗碱含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相：乙腈∶0.1mol/L 磷酸二氢钾水溶液(30 ∶70)，流速1.0 mL/min，波长345 nm，柱温:室温，进样量 20μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱对照品2.44 mg，用上述流动相溶解并定容至50 mL，得浓度为0.0488 mg/mL的溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

2.2.2.2 供试品溶液 按处方量等比例缩减后称取每份约为2.0g，加8倍量的蒸馏水，浸泡60 min，加热回流1.0 h，提取3次，将提取的药液浓缩并定容成50 mL。经纯化后精密量取5 mL用上述流动相定容成25 mL，充分摇匀后4000 r/min离心30 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

2.2.2.3 阴性对照溶液 取处方中去黄柏的其他药材，按供试品溶液制备方法制成缺黄柏的阴性样品。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 系统适用性实验 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，理论塔板数不低于4000。色谱峰与相邻峰之间分离度大于1.5(如图1所示)。

图1 盐酸小檗碱图表

2.2.3.2 制备标准曲线 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8 mL，分别置于10mL容量瓶中，加流动相稀释到刻度，在“2.2.1”项下方法分别测定，以对照品浓度(X)为横坐标，相应对照品峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为y=64389723.27x+218364.62，r=0.9993，结果表明盐酸小檗碱含量在4.88～39.04μg的范围内有良好的线性关系。

2.2.3.3 精密度试验 精密取对照品溶液各20μL，按“2.2.1”项下方法重复进样 6 次，计算盐酸小檗碱的色谱峰面积。RSD为1.02%，表明本仪器精密度良好。

2.2.3.4 重复性试验 精密称取处方中药材粉末共 6 份，各2 g，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备6份溶液，各取20 μL，在“2.2.1”项下方法测定盐酸小檗碱的色谱峰面积。计算RSD为1.60%，表明此方法重现性良好。

2.2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h，在“2.2.1”项下方法测定盐酸小檗碱色谱峰面积。计算RSD为2.58%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.3.6 加样回收试验 精密称取已知含量(11.7136 mg/g)供试品共 6 份，各1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，再分别精密加入盐酸小檗碱对照品适量，适当稀释后按“2.2.1”项下条件测定峰面积，计算加样回收率[6-7]。平均回收率为99.45%，RSD为1.28%。结果见表1。

表1 盐酸小檗碱加样回收试验结果

2.3 正交试验优选工艺 根据单因素实验结果分析得出清膏相对密度、起模的粉水比例、干燥温度、干燥时间对溶散时限、小檗碱含量的影响更为显著，故选择这4个因素做正交试验，以溶散时限、小檗碱含量为评价指标，按照L9(34)表进行正交实验[8-9]，并按0.6∶0.4的权重系数对这 2个指标进行综合评分。结果见表2、3、4。

表2 因素水平表

表3 正交实验结果表

表4 方差分析表

由表3的结果可知，各考察因素对益肾涤浊丸制备工艺影响依次为：干燥时间>相对密度>干燥温度>粉水比例，且干燥时间对工艺影响较大。从表4看出各因素影响不显著(P>0.05)。从K值可知通过正交实验优选的益肾涤浊丸制备工艺的最优水平搭配为A3B2C1D1，即干燥温度为80℃，清膏相对密度为1.15，起模的粉水比例为1∶1，干燥时间为8h。

2.4 验证实验 按实验所确定益肾涤浊丸的最优制备工艺为干燥温度为80℃，清膏相对密度为1.15，起模的粉水比例为1∶1，干燥时间8h的条件下进行验证试验，结果测溶散时限均符合2015版中国药典规定，均在1h内溶散，水丸光滑圆整，色泽鲜亮，大小均一，盐酸小檗碱含量(mg·g-1)分别为11.8925、11.2398、12.0078，平均为11.7134，RSD为1.54%。

3 讨论

泛丸的制备工序主要为粉碎、起模、成型、盖面、干燥[10]。益肾涤浊丸的原制备工艺也是用此工序，制备的成品符合中国药典中有关丸剂的规定，但没有进行最佳工艺优选研究，本次实验用正交实验筛选最佳工艺，以期得到高效实用的制备工艺。实验以溶散时限为考察指标[11-12]，溶散时限是丸剂检查的必要项目，合理的溶散时限既能保证丸剂的稳定性，又能保证丸剂的吸收利用度。本次的实验结果表明本次所制水丸的溶散时限全部符合规定。

从组方中可知小檗碱是其主要有效成分之一，其中黄柏中的小檗碱有抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、免疫调节、抗心律失常等药理作用。因此本实验同时以小檗碱含量为考察指标。由验证实验可看出该工艺所得的小檗碱含量也较高。实验结果表明益肾涤浊丸制备工艺的最优水平搭配为A3B2C1D1，即粉水比例为1∶1，相对密度为1.15，干燥温度为80 ℃，干燥时间8 h。且各考察因素对益肾涤浊丸制备工艺影响依次为：干燥时间>相对密度>干燥温度>粉水比例。干燥时间与相对密度对工艺影响较大，二者有无相关性有待进一步研究。

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