利用线粒体DNA控制区鉴别狼与狗可行性分析

2018-06-26江泓慧徐艳春

野生动物学报 2018年2期

江泓慧李波，2* 马跃，2 徐艳春，2*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040;2.国家林业局野生动植物检测中心，哈尔滨，150040)

灰狼(Canis lupus)发源于距今300多万年前的更新世，由汤氏熊分化为现代犬属动物［1］。狗(Canis familiaris)是狼的近亲，通过对狼和狗表现型和基因型的研究发现狼是狗的野生祖先［2－3］，即狗由早期人类从灰狼驯化而来［4］，驯养始于亚洲，距今不超过16300年［5］。狼和狗具有相同的染色体组型，可以杂交并产生后代，有学者将二者描述为同一物种［6］。

狼作为数量有限的野生动物受到众多国家法律保护，已被列入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》，在世界范围内受到严格的保护和管理，禁止非法捕杀及贩卖。狗则被视为人类的伴侣动物，不被野生动物相关法律保护。狼皮、牙、胃等在非法市场具有较大的需求，非法偷猎，走私狼产品在中国境内和周边地区时有发生。当执法部门查获相关的狼产品时，嫌疑人为逃避法律惩罚经常谎称其产品来源于狗。为打击非法偷猎、走私活动，保护野生狼的种群，急需建立一套有效的狼与狗鉴别方法。

传统的物种鉴别方法可以分为宏观和微观两种。宏观鉴别中的形态学［7］及行为学［8－9］方法是快速且准确的。但通常需要涉案检材有完整的特征。当所缴获物品为动物的内脏或局部组织时，则需要采取微观的分子生物学技术进行鉴别。其中，最常见的是利用线粒体DNA(mtDNA)作为分子标记的方法。多拷贝的mtDNA没有基因重组现象，严格遵循母系遗传，其进化速率是单拷贝核基因的5～10倍［10］，它是动物系统发育分析和物种识别常用的工具。通过mtDNA，包括线粒体细胞色素b基因(Cyt b)及控制区［11－13］等对狼和狗的研究始于20世纪。最近的犬科动物分子系统学研究发现犬属的狼和狗等为系统树中独立的分支，其分支时间较赤狐(Vulpes vulpes)、蓝狐(Alopex lagopus)和貉(Nyctereutes procyonoides)早［14］，验证了狼和狗具有较其他犬科动物更为亲近的关系。也有研究比较了狼和狗线粒体全基因组的结构特点，并进一步探索其物种起源与进化［15］。

在物种识别方面，有人利用mtDNA控制区对克罗地亚境内狼和狗进行鉴别，结果证明该段序列可以成功将狼和狗鉴别开来［16］。由此，本研究比对中国境内及周边国家狼和狗mtDNA控制区序列，通过序列差异比较和系统发育分析探索利用控制区对狼和狗进行物种鉴别的可行性。该分子方法的建立可以丰富狼和狗鉴别手段，为动物法医学相关鉴别提供助力［17］。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源于国家林业局野生动植物检测中心保存的狼和狗肌肉组织样本。全部样本来源于中国境内。其中56份样本为狗，18份样本为狼。另有来源于日本、蒙古、阿富汗等国的24条狗mtDNA控制区序列，8条狼 mtDNA控制区序列及2条外群灰狐(Urocyon cinereoargenteus)mtDNA控制区序列下载自GenBank。经统计共108份试验材料，80份来自于狗，26份来自于狼，2份来自于灰狐。本实验所用全部试验材料信息详见表1。

1.2 DNA提取

肌肉组织采用AxyPrep基因组DNA提取试剂盒(康宁生命科学有限公司，吴江)提取，于－20℃条件下保存。

1.3 PCR扩增

使用引物 DL 14和 DH 7［18］扩增目标 mtDNA片段。PCR扩增体系为50 μl，包含10 ng模版DNA，1×EasyTaq Mix(北京全式金生物技术有限公司，北京)及上下游引物各200 nM。使用Eppendorf Mastercycler Pro PCR仪进行扩增，扩增条件为:94℃预变性5 min，随后35个循环(94℃/30 s，50℃/30 s，72℃/60 s)，最终72℃保温5 min。采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(康宁生命科学有限公司，吴江)，按照操作手册进行纯化回收。

1.4 数据分析

纯化产物由哈尔滨新海基因生物有限公司利用3730测序仪采用一代测序技术测定，以引物DL 14单向测序进行分析测定。用MEGA 5软件对所测序列进行比对，截取并保留序列约676 bp的片段，分析单倍型成对序列遗传距离;用Arlequin 3.5.2.2［19］分析单倍型频率;用dnasp 5分析多态位点，单倍型多样性和核酸多样性;用IQ－TREE和MrBayes3.2.6软件分别构建ML系统发育树和贝叶斯树，选择两个灰狐单倍型为外群。

2 结果

2.1 序列分析

分析106条狼和狗mtDNA控制区约676 bp部分序列，共得到47个单倍型结果，其中12个来源于狼，35个来源于狗，且狼和狗之间没有共享单倍型。这些单倍型包含了62个(9.17%)多态位点(表2)。狼有51个多态位点(7.54%)，狗有33个多态位点(4.88%)。狼有29个特异多态位点，狗有11个特异多态位点，二者占全部多态位点的64.52%。分析序列核苷酸多样性(Pi)和单倍型多样性(Hd)，结果表明狼 Pi值为 0.015，Hd值为 0.914，狗 Pi值为0.012，Hd值为0.957。狼的单倍型频率介于3.85%～15.40%之间，狗的单倍型频率介于1.25% ～10.00%之间(表3)，狼和狗种内单倍型频率主要集中于低频区域。表明不同的mtDNA控制区单倍型在狼和狗各自世系间分布较为均匀，且存在优势单倍型。

2.2 系统发育分析

ML和BI方法构建的单倍型系统发育树拓扑结构一致，各分支的支持度存在差异(图1)。系统发育分析表明，全部狼和狗的单倍型独立于外群形成2大分支或世系(支持度为100%)。第一分支中包含3个狼单倍型、8个狗单倍型，其中3个狼单倍型(WN03、AB007373、AB007374，25%)与5个狗单倍型共享同一世系。第二分支中包含36个单倍型(9个狼单倍型、27个狗单倍型)，其中狼单倍型(75%)与狗单倍型分属不同分支。且狼单倍型 AB007375，WE01和WB01，WB02和 WC05总是独立成支(支持度＞80%)。

3 讨论

mtDNA被广泛用于动物遗传进化，系统发育，群体遗传结构等方面的研究［13，20－23］。分别有研究对青海湖附近18头狼［13］及24个不同品种共73只狗［24］的mtDNA控制区序列进行研究。结果表明同一地区狼之间及不同品种狗之间mtDNA控制区均具有广泛的多态性，证明二者遗传多样性较高。为比较狼和狗mtDNA控制区单倍型并分析得到更加广泛的多态性提供了可能性依据。本研究分析狼和狗单倍型序列多态位点的差异，结果狼有29个特异性位点，狗有11个特异性位点，证明狼和狗之间具有更高的遗传多样性。二者的显著差异是本方法鉴别狼和狗的基础，说明在mtDNA控制区676 bp段序列范围内，狼和狗具有各自独立的进化，为本研究鉴别方法提供了可行性。

利用mtDNA进行动物系统发育分析，有助于物种的起源［25］及分类地位［26］等方面的研究，对于不同种动物则可进一步对进化多样性及物种鉴别进行研究。已有研究利用mtDNA控制区对羊、滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)、沙氏下鱵鱼(Hyporhamphus sajori)等动物的进化多样性及物种鉴别［27－31］展开研究。在犬科动物方向，有研究利用mtDNA控制区对济州犬与其他犬种的种内系统发育关系进行了研究［32］;在利用mtDNA控制区对克罗地亚地区的狼和狗进行种间区分的研究中，系统发育分析结果表示狼和狗具有各自独立的世系，可以利用此方法鉴别狼和狗［19］。本研究利用全部47个狼和狗单倍型构建系统发育树，在来自中国境内及周边国家的12个狼单倍型中有9个(75%)与狗单倍型均分属不同分支。这说明系统发育树中单倍型的世系分布也具有一定的鉴别力。而另一方面，长期进化发展及基因交流等原因为狼和狗的基因分化带来一定的干扰因素，导致少部分狼(25%)和狗具有相似的mtDNA单倍型，使得本方法的鉴别准确度降低。因而根据狼和狗mtDNA控制区单倍型在系统发育树中的分布结果鉴别狼和狗，准确率较高，但有无法鉴别的情况存在。

综合特异性位点和单倍型世系分布分析结果，推测利用mtDNA控制区鉴别狼和狗是可行的。但mtDNA母系遗传的特点使得本方法在杂合子鉴别方面存在障碍，如本研究全部(75%部分和25%部分)狼单倍型个体中是否存在雌狼和雄狗杂交的后代，或者雌狼和杂种后代产生的后代，需要进一步综合常染色体或Y染色体等遗传标记［33］进行父系鉴别。综上，本研究方法对狼和狗的鉴别具有一定的可行性及参考意义，但仍需要更广泛地选取样本进行深入研究。

［1］高中信，袁力，付松华．狗与狼［J］．野生动物，1997，18(6):29－30．

［2］ Vilà C，Savolainen P，Maldonado J E，et al．Multiple and ancient origins of the domestic dog［J］．Science，1997，276(5319):1687－1689．

［3］ Wayne R K，Ostrander E A．Origin，genetic diversity，and genome structure of the domestic dog ［J］．BioEssays，1999，21(3):247－257．

［4］ Leonard J A，Wayne R K，Wheeler J，et al．Ancient DNA evidence for Old World origin of New World dogs［J］．Science，2002，298(5598):1613－1616．

［5］ Parker H G，Kim L V，Sutter N B，et al．Genetic structure of the purebred domestic dog［J］．Science，2004，304(5674):1160 －1164．

［6］ Vilà C，Wayne R K．Hybridization between wolves and dogs［J］．Conservation Biology，1999，13(1):195 －198．

［7］ Janssens L，Spanoghe I，Miller R，et al．Can orbital angle morphology distinguish dogs from wolves［J］．Zoomorphology，2016，135(1):149－158．

［8］ Range F，Virányi Z．Social learning from humans or conspecifics:differences and similarities between wolves and dogs［J］．Frontiers Psychology，2013，4:868．

［9］ Udell M A R．When dogs look back:inhibition of independent problem-solving behaviour in domestic dogs(Canis lupus familiaris)compared with wolves(Canis lupus) ［J］．Biology Letters，2015，11(9):20150489．

［10］ Brown W M，George M，Wilson A C．Rapid evolution of animal mitochondrial DNA ［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76(4):1967 －1971．

［11］ Pereira L，Van Asch B，Amorim A．Standardisation of nomenclature for dog mtDNA D-loop:a prerequisite for launching a Canis familiaris database ［J］．Forensic Science International，2004，141(2/3):99－108．

［12］窦海龙，沙未来，陈磊，等．基于线粒体D-Loop区的青海狼种群遗传学研究［C］∥中国动物学会，中国生态学学会，中国野生动物保护协会．第八届全国野生动物生态与资源保护学术研讨会论文集，2012:152－153．

［13］ Eichmann C，Parson W．Molecular characterization of the canine mitochondrial DNA control region for forensic applications［J］．International Journal of Legal Medicine，2007，121(5):411－416．

［14］陈永久，张亚平，邹希明．犬科的线粒体细胞色素b DNA序列及其分子系统学研究［J］．遗传学报，2000，27(1):7－11．

［15］孟超．中国狼、犬科及部分食肉目动物线粒体全基因组研究［D］．曲阜:曲阜师范大学，2009．

［16］Sindiˇcic'M，Gomerˇcic'T，Galov A，et al．Mitochondrial DNA control region as a tool for species identification and distinction between wolves and dogs from Croatia ［J］．Veterinarski Arhiv，2011，81(2):249－258．

［17］ Budowle B，Garofano P，Hellman A，et al．Recommendations for animal DNA forensic and identity testing［J］．International Journal of Legal Medicine，2005，119(5):295－302．

［18］ Tsuda K，Kikkawa Y，Yonekawa H，et al．Extensive interbreeding occurred among multiple matriarchal ancestors during the domestication of dogs:evidence from inter-and intraspecies polymorphisms in theD-loop region ofmitochondrialDNA between dogsand wolves［J］．Genes ＆ Genetic Systems，1997，72(4):229 －238．

［19］ Excoffier L，Laval G，Schneider S．Arlequin(version 3.0):anintegrated software package for population genetics data analysis［J］．Evolutionary Bioinformatics Online，2005，1(4A):47－50．

［20］ Kim K S，Lee S E，Jeong H W，et al．The complete nucleotide sequence ofthe domestic dog(Canisfamiliaris)mitochondrial genome［J］．Molecular Phylogenetics and Evolution，1998，10(2):210－220．

［21］ Bjornerfeldt S，Webster M T，Vilà C．Relaxation of selective constraint on dog mitochondrial DNA following domestication［J］．Genome Research，2006，16(8):990－994．

［22］ Ishiguro N，Inoshima Y，Shigehara N．Mitochondrial DNA analysis of the Japanese wolf(Canis lupus hodophilax Temminck，1839)andcomparison with representative wolf and domestic dog haplotypes ［J］．Zoological Science，2009，26(11):765－770．

［23］ Verscheure S，Backeljau T，Desmyter S．Coding region SNP analysis to enhance dog mtDNA discrimination power in forensic casework ［J］．Forensic Science International:Genetics，2015，14:86－95．

［24］ Okumura N，Ishiguro N，Nakano M，et al．Intra-and interbreed genetic variations of mitochondrial DNA major non-coding regions in Japanese native dog breeds(Canis familiaris) ［J］．Animal Genetics，1996，27(6):397 －405．

［25］ Savolainen P，Zhang Yaping，Luo Jing，et al．Genetic evidence for an East Asian origin of domestic dogs［J］．Science，2002，298(5598):1610－1613．

［26］李隐侠，李齐发，刘振山，等．藏獒线粒体DNA D-loop区序列测定及其分类地位研究［J］．南京农业大学学报，2009，32(2):107－111．

［27］陈睿赜，张英杰，刘月琴．mtDNA分析在羊进化多样性及种属鉴别中的应用［J］．中国草食动物科学，2012(Z1):75－78．

［28］柳燕，李莉．线粒体 DNA cytb和 HVI的分析用于种属鉴定［J］．中国司法鉴定，2006(4):14－17．

［29］卞晓东，张秀梅，肖永双，等．线粒体DNA序列在沙氏下鱵鱼鱼卵鉴别上的应用［J］．中国海洋大学学报:自然科学版，2007，37(S1):111－116．

［30］赵亮，刘志瑾，任宝平，等．滇金丝猴线粒体D-loop片段SNPs位点的鉴别及初步分析［J］．兽类学报，2010，30(3):239－246．

［31］ Lalitha R，Chandavar V R．Intraspecific variations in Cyt b and D-loop sequences of Testudine species，Lissemys punctata from south Karnataka［J］．Journal of Advanced Research，2018，9:87 －95．

［32］ Kim M G，Kim N Y，Lee S S，et al．Phylogenetic relationships of jeju dogs to other domestic and foreign dog breeds determined by using mtDNA D-loop sequences［J］．Journal of Animal Science and Technology，2011，53(4):303－310．

［33］ Vilà C，Walker C，Sundqvist A K，et al．Combined use of maternal，paternal and bi-parental genetic markers for the identification of wolf-dog hybrids［J］．Heredity，2003，90(1):17－24．