辽宁爪鲵(Onychodactylus zhaoermii)与吉林爪鲵(O.zhangyapingi)的遗传多样性

栾东岳，原 野，徐 昕，董丙君，杨宝田

(1.沈阳师范大学生命科学学院，辽宁沈阳110034；2.鞍山市野生动植物保护管理工作站，辽宁鞍山114004)

[通讯作者]杨宝田(1963- )，男，副教授，硕士生导师，博士，从事野生动物保护与利用、分子生态学研究。

辽宁爪鲵(Onychodactyluszhaoermii)和吉林爪鲵(O.zhangyapingi)隶属于两栖纲(Amphibia)有尾目(Caudata)小鲵科(Hynobiidae)爪鲵属(Onychodactylus)[1]。此两种爪鲵是Poyarkov et al.(2012)[2]在对东北亚分布的爪鲵物种形态和分子数据研究基础上，从原属于Onychodactylusfischeri[3]中分离出的新物种，目前已知分布在辽宁省(岫岩)和吉林省(浑江、临江、集安、白河、延吉)的长白山及其余脉[1]，本研究在辽宁辽阳县甜水满族乡发现有辽宁爪鲵分布。两种爪鲵栖息地环境较为相似，均在山高林密，杂草丛生，常年流水的溪流中或其附近。爪鲵多以陆地栖息为主，昼伏夜出，黄昏和雨后活动较为频繁[1,4]，常见于土缝与溪中石缝间。以溪流内的小虾及小昆虫为食[1,5]。

爪鲵以其指、趾末端具有黑色角质爪而得名，与其他小鲵科动物的明显区别是其无肺[1]。辽宁爪鲵与吉林爪鲵的形态结构差异在于辽宁爪鲵的犁骨齿明显弯曲，齿数在16～17个且没有缝隙，而吉林爪鲵的犁骨齿较为平整，齿数在13～14个且没有明显缝隙[1-2]。近些年国内有关爪鲵的研究多集中在形态与组织解剖学[6-9]、生理学[10-11]、保护生物学[5,12]和生态学[13]等方面。分子方面的相关文献多来自国外学者或机构的研究，Yoshikawa et al.(2008)[14]对爪鲵系统发生关系和谱系地理学进行研究，利用线粒体Cytb基因序列对日本爪鲵种群系统关系和地理演化进行了分析，认为日本爪鲵存在4个支系，地质事件(日本海的开放)和气候变化是日本爪鲵种群分化的主要影响因素。

生物多样性的核心是遗传多样性，生物进化潜力由种内的变异程度决定，物种对环境变化适应能力的增强，是由于种内的遗传多样性丰富度的上升。保护生物遗传多样性的本质就是保护生物多样性[15]。本研究采用Cytb基因序列分析方法对分布于我国的2种爪鲵进行种群遗传学研究。通过对其遗传多样性的分析，评估遗传多态性的程度和分布，为爪鲵物种保护提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 样本

本研究野外采集样本共计73个(表1)，其中吉林爪鲵43个，辽宁爪鲵30个。野外样本分别来自吉林省集安市五女峰(8个)、通化市石湖镇(18个)、通化市老岭(17个)，辽宁省岫岩县三家子(26个)、辽阳县大黑山(4个)等5个地理种群。采集爪鲵样本取后尾部末端组织或肢趾尖，放置于无水乙醇中固定带回实验室保存于-25℃冰箱中，样本采集后爪鲵个体放生。此外，在GenBank下载线粒体Cytb基因序列15条，来自辽宁爪鲵8条，其中2条来自吉林通化老岭；来自吉林爪鲵序列7条，其中4条来自吉林临江(JLLJ)。用以分析的线粒体Cytb基因序列共计88条。

表1 采集的样本信息

1.2 总DNA提取、Cytb基因PCR扩增和测序

采用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取基因组DNA，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。提取的DNA存放在-20℃冰箱内保存待用。线粒体Cytb基因DNA扩增所用引物如表2，引物由北京华大基因有限公司合成。线粒体Cytb基因PCR扩增反应体系为25μL，10×Buffer 2.5μL；MgCl22.5μL；dNTP 2μL(10mmol/L)；引物 2μL(10pmol/μL)，上下游引物各1μL(10pmol/μL)；TaqDNA聚合酶1U，模版DNA 100ng/2μL；加双蒸水至25μL。PCR反应程序如下：94℃预变性8min，之后94℃变性30sec，51～57℃退火30sec，72℃延伸45sec，运行35个循环后，72℃再延伸10min。PCR反应在Applied Biosystems Inc. 2720 PCR仪或Applied Biosystems Inc. 9902 PCR仪中进行。PCR产物经电泳检测后由北京华大基因有限公司测序。

表2 用于爪鲵线粒体Cytb基因扩增的引物

1.3 数据处理与分析

将所测得的Cytb基因片段首先进行Blast搜索，验证其可靠性；然后用Lasergene v.7.0对DNA片段进行拼接和手工编辑校正；再利用Clustal X[16]对拼接好的基因序列进行比对；最后采用脊椎动物线粒体遗传密码子进行序列翻译，以排除假基因的存在并证明其准确性。用DAMBE[17]检测Cytb基因序列的碱基替换模式，以检验它们是否发生碱基替换饱和效应。用DNAsp 5.10[18]软件计算单倍型多态性和核苷酸多样性等遗传多样性指数，同时进行中性(Tajima’s Test; Fu and Li’s Tests)检测和连锁不平衡(Linkage Disequilibrium)检测。用MEGA 6.0[19]软件分析不同样本序列间的碱基组成和变异位点，并计算基于Kimura双参数模型的遗传距离、构建NJ系统树。利用Arlequin 3.5[20]软件进行遗传结构分析和分子方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)。单倍型网络关系图用TCS 1.20[21]软件完成。

2 结果与分析

2.1 线粒体Cytb基因序列特征

两种爪鲵线粒体DNA Cytb基因经PCR扩增后得到的序列长度有所不同，辽宁爪鲵Cytb基因长度为1146bp，吉林爪鲵Cytb基因长度为1149bp。相对于吉林爪鲵Cytb基因，辽宁爪鲵Cytb基因在1098-1100bp处存在“GTT”3个碱基的缺失。将所获得的Ctyb基因序列通过进行Blast同源性搜索以确定其可靠性。Cytb基因为氨基酸编码基因，我们采用脊椎动物线粒体遗传密码子进行序列翻译，以排除假基因的存在并证明其准确性。在Cytb基因序列中，辽宁爪鲵样本A+T含量为68.1%，吉林爪鲵样本的A+T含量为67.7%，二者非常接近，都明显高于G+C的含量，此数据符合脊椎动物线粒体碱基组成的基本特征。

2.2 线粒体Cytb基因遗传变异

结合GenBank下载数据，辽宁爪鲵共38条Cytb基因序列，存在16个变异位点，其中有8个简约信息位点。核苷酸多样性(π)和平均核苷酸差异数(k)分别为0.00265和3.3037(表3)。定义单倍型(h)9个(单倍型多样度Hd=0.721)(表4)。

表3 两种爪鲵Cytb基因遗传多样性参数

注:圆括号内数字为标准误差。

表4 辽宁爪鲵线粒体Cytb单倍型及变异位点分布

吉林爪鲵的50条Cytb基因序列存在21个变异位点，其中有19个简约信息位点。核苷酸多样性(π)和平均核苷酸差异数(k)分别为0.00480和4.2210(表3)。定义单倍型(h)7个(单倍型多样度Hd=0.571)(表5)。

表5 吉林爪鲵线粒体Cytb单倍型及变异位点分布

采用Kimura-2计算的种群内平均遗传距离(表6中对角线数据)表明种群内个体间的遗传距离非常小，最大的为JLTH种群(0.0041)，最小的为JLLJ和JLLL两个种群(0.0000)。辽宁爪鲵种群内平均遗传距离为0.00266±0.00254，吉林爪鲵为0.00486±0.00100。

单倍型网络关系图(图1)显示单倍型间无对应种群分支结构，单倍型间接近，突变步数较少。

图1 单倍型网络关系

注:每个椭圆形代表一个定义的单倍型，椭圆的大小表示该单倍型的频率。“○”表示理论分析得出、但没有实际观测到的单倍型。单倍型间的每一连线代表一个突变步骤。

2.3 种群分歧与遗传结构分析

用MEGA软件计算的线粒体Cytb基因序列种群内和种群间的遗传距离结果(表6)显示，两个爪鲵物种种群间的遗传距离非常小，大多数种群间的遗传距离都小于1%，只有吉林爪鲵的临江种群与其他种群的遗传距离大于1%(1.9%～2.1%)。

表6 种群内和种群间Cytb基因序列遗传距离分析

注:下三角为遗传距离，上三角为标准误，对角线为种群内平均遗传距离。

遗传分化指数(FST)分析显示(表7)，辽宁爪鲵种群间分化状况不平衡，JLLL种群与LNXY种群和LNDHS种群分化明显(p<0.05)，而LNXY种群与LNDHS种群则无明显遗传分化(p≥0.05)。对辽宁爪鲵种群间基因流(Nm=0.91,Nei 1982)分析可以看出种群间基因交流程度不高。

表7 辽宁爪鲵种群间FST

注:下三角为FST值；上三角为统计检验p值，*为p<0.05水平差异显著。

对辽宁爪鲵进行分子方差分析(AMOVA)，将辽宁的两个种群划为一组，吉林的辽宁爪鲵(JLLL)划为另一组，分析结果显示2个分组之间的变异在总变异中占到65.91%，而组内种群间的变异占比非常小，只有0.56%(表8)。结合种群间FST分析(表7)可以看出，这种占比特征主要是JLLL种群与其他种群差异引起。

FST=0.66478(p<0.05)。

对吉林爪鲵的遗传分化指数(FST)分析，吉林爪鲵除吉林临江种群与其他种群存在较大分化外(p<0.05)，其余种群间均无明显遗传分化(p≥0.05)(表9)。吉林爪鲵种群间基因流Nm=0.18(Nei 1982)。

表9 吉林爪鲵种群间FST

注:下三角为FST值；上三角为统计检验p值，*为p<0.05水平差异显著。

对吉林爪鲵进行分子方差分析(AMOVA)，由于各样本采集地相对比较集中，均属于长白山南部山地，因此没有将其进行分组设计，仅对种群与个体两个阶层进行分析。结果显示种群之间的变异在总变异中占到67.43%，而种群内的变异占比相对较小(32.57%)(表10)。结合种群间FST分析(表9)可以看出，这种占比特征主要由JLLL种群与其他种群的差异引起。

表10 吉林爪鲵AMOVA分析

FST=0.67435(p<0.05)。

鉴于上述分析中分化程度较大的爪鲵种群来自Nikolay et al.(2012)[2]的DNA序列，即作为辽宁爪鲵JLLL种群和吉林爪鲵JLLJ种群的样本，本研究去掉这部分样本，用自测的DNA数据重新做了遗传结构分析。在所分析的2个辽宁爪鲵种群间(LNXY vs LNDHS)的分化指数(FST)为0.035，而吉林爪鲵的3个种群(JLSH、JLWNF和JLTH)之间的遗传分化指数均为0.000。在没有进一步对种群分组的情况下(因采样种群自然地理区系相同，地理距离很近)，辽宁爪鲵种群间遗传变异只占总变异的3.000%，而吉林爪鲵种群间的遗传变异占比为0.000%。

图2 用自测DNA数据所做AMOVA分析图

2.4 线粒体Cytb基因系统发生关系

在GenBank下载线粒体Cytb基因序列116条(Nikolay et al.,2012)[2]，包括O.fischeri、O.koreanus、O.cf.japonicus、O.sp.、O.nipponoborealis等5个爪鲵物种(或新种)。结合本研究中自测的73条序列，共计189个爪鲵Cytb基因序列，采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)用MEGA6.0软件构建系统关系树，结果如图3。从图中可以看出这些爪鲵物种(种群)可以分成3枝，O.cf.japonicus、O.nipponoborealis和O.zhangyapingi聚为一枝，O.koreanus、O.sp.和O.zhaoermii为一枝，O.fischeri单独一枝。O.fischeri显示为较原始类群(物种)，处于系统树的根部。

注：节点处数值为置信值，没有标示数值的节点置信值低于60。图3 用7个爪鲵物种189条Cytb序列构建的邻接树

3 讨论

3.1 两种爪鲵的遗传多样性比较

Cytb基因标记结果显示辽宁爪鲵和吉林爪鲵遗传多样性较低。从变异位点、简约信息位点、核苷酸多样性(π)、平均核苷酸差异数(k)和单倍型多样度等多个遗传多样性参数上可以得出这一结果。就2个爪鲵物种进行比较，吉林爪鲵在多态位点数、核苷酸多样性和平均核苷酸差异数上略高于辽宁爪鲵，但其单倍型数和单倍型多样性低于辽宁爪鲵。在种群遗传多样性变化趋势上，吉林爪鲵的遗传多样性高于辽宁爪鲵。在遗传多样性研究中分子标记的选择和应用对结果有十分重要的影响。线粒体DNA分子标记优点是不受环境和其他因素的影响而直接以DNA的形式出现，其具有母系遗传、选择中性、进化速率快且稳定等特点。一般来说，种群遗传多样性高低受种群自身特点的影响，但动物种群线粒体DNA所反映的遗传多样性基本和种群大小无关。Frentiu et al.(2001)[22]在对澳洲肺鱼的研究中发现从控制区至ATPase 8的线粒体DNA序列有很少的遗传变异。

3.2 遗传分化与遗传结构

基于线粒体Cytb序列的辽宁爪鲵种群间遗传变异分析，种群遗传距离(表6)和遗传分化指数(FST，表7)均显示了一致的结果，即分布于吉林的JLLL种群与分布于辽宁的2个种群(LNDHS & LNXY)分化程度很大，而辽宁分布LNDHS种群与LNXY种群具有中等程度分歧。对吉林爪鲵种群分析，遗传距离(表6)和FST(表9)显示JLLJ种群与其他3个种群(JLSH & JLWNF & JLTH)存在很大遗传分化，而JLSH、JLWNF和JLTH种群间无分化或仅有很小分化。在上述利用Cytb基因所做分析中，两种爪鲵显示较大分化的种群(辽宁爪鲵JLLL种群和吉林爪鲵JLLJ种群)数据出自Nikolay et al.(2012)，如果采用本研究自测的DNA数据重新分析，辽宁爪鲵LNXY种群与LNDHS种群的分化指数为0.035，而吉林爪鲵3个种群(JLSH & JLWNF & JLTH)之间的遗传分化指数均为0.000，即辽宁爪鲵2个种群间存在较小遗传分化(0 < FST< 0.05)，吉林爪鲵3个种群间均无遗传分化(FST=0.000)。

本研究从辽宁爪鲵、吉林爪鲵和辽宁爪鲵+吉林爪鲵三个侧面进行了遗传结构分析。将辽宁爪鲵LNXY种群和LNDHS种群划为一组，JLLL种群为另一组的情况下，分子方差分析结果表明，组间的变异占65.91%，成为遗传变异的主要来源。对吉林爪鲵4个种群的AMOVA分析，变异主要来自于种群间(67.43%)。用自测Cytb数据重新分析，将JLLL种群数据去掉，不进行组别划分，则辽宁爪鲵种群间遗传变异占总变异的份额为3%，FST=0.035；同样，去掉JLLJ种群数据，吉林爪鲵的遗传变异则全部来自于个体间(100%)，FST=0.000，辽宁爪鲵和吉林爪鲵种群间的变异占比都非常小，辽宁爪鲵种群略大于吉林爪鲵。将辽宁爪鲵和吉林爪鲵合并AMOVA分析，则种间的变异占到98.82%，种群间和个体间的变异仅占1.18%。

交配系统和扩散机制对动物种群的遗传分歧水平有显著影响。爪鲵栖息于海拔500至1000米植被茂密的山区，水质清凉、多碎石的溪流、水沟或泉眼附近是其常栖之地。由于爪鲵依赖水环境且对水质条件要求苛刻，极大限制了爪鲵的迁徙扩散能力，因而分布地域狭窄。爪鲵只能集中在所处栖息地繁衍，从而限制了基因交流，进而导致了一定程度的遗传分化。环境因子的差异所导致的选择差异在爪鲵种群遗传分化中起了重要作用。

3.3 系统发生关系与地理演化

线粒体DNA是动物亲缘地理学最常用的遗传标记，尽管随着新一代测序技术的普遍应用而有所下降，但在已发表的有关谱系地理研究中仍占据较大份额。线粒体DNA具有高突变率、PCR扩增对模板要求低、在动物组织中拷贝数多等优点，特别是线粒体DNA在种内多态性为中性，不受选择影响，因而能更好反映种群经历的历史事件。动物线粒体DNA极少重组，每一个单倍型对应一个前一世代祖先，所以很容易推断单倍型间的遗传关系，进而通过单倍型分布和相对频率推断种群历史地理关系。本研究辽宁爪鲵单倍型网络关系显示出典型的星状模式(图1)，新单倍型(Hap_1-2, Hap_4-7)的形成发生在出现频率最高的单倍型(Hap_3)，后续的核苷酸突变不可能发生在相同位点，因而这些稀少的新单倍型出现频率和数目较低。尽管研究样本采自分属不同行政区域的两个地点，但辽宁爪鲵地理分布的狭域性使其依然构成一个独立分化中心。与辽宁爪鲵有所不同，吉林爪鲵显示出相对复杂的单倍型网络关系(图1)，单倍型Hap_1占有主导地位，但Hap_3频率出现次级峰。Hap_1与Hap_3间单倍型距离很近(仅一步突变)，可能是由于短暂的遗传隔离因素形成，由二者衍生出来的稀少卫星单倍型(Hap_2, Hap_4)很少。

地理隔离和扩散能力是一个物种地理分布格局形成的决定因素，狭域分布的物种也很少有以单一的未分化的种群存在。基于Cytb基因的系统发生关系显示(图3)，辽宁爪鲵种群呈现多系谱系关系，亦即来自不同种群的一些样本携带来自不同进化枝的单倍型。这从另一个方面反映在辽宁爪鲵种群间很少地理隔离或无隔离因素存在，种群间基因交流频繁。同样，吉林爪鲵种群也表现为多系谱系关系，各种群没有形成独立进化枝。但辽宁爪鲵与吉林爪鲵却分属2个不同的进化枝，辽宁爪鲵与O.sp.和O.koreanus构成一支，而吉林爪鲵与O.cf.japonicus和O.nipponoborealis构成一支，O.fischeri位于树的根部单独一支。爪鲵属在28.7MYA渐新世中期从其它小鲵中分离出来，分布于东北亚地区的山地森林中[14]。在第三纪中新世的早期，大概15.5 MYA，俄罗斯的O.fischeri和其他世系首先在爪鲵属中分离出来。基于Yoshikawa et al.(2008)的分析，日本分布的爪鲵最早于8.1 MYA与东北亚大陆分布的爪鲵分离[14]，而中国东北与朝鲜半岛分布的爪鲵则在5.5 MYA分离，而在本研究中中国东北的2种爪鲵分属日本和朝鲜半岛2个不同的进化枝，这其中的矛盾和东北亚地区爪鲵物种系统发育和地理演化关系有待于进一步深入研究。

两栖类动物种群的普遍衰退是当今普遍现象，两栖动物迁移能力低，当种群变得小而隔离时，在遗传问题方面变得特别脆弱。鉴于辽宁爪鲵和吉林爪鲵种群呈现多系的谱系结构，因而建议将2个物种分别作为一个管理单元加以保护。两种爪鲵(特别是辽宁爪鲵)已知分布区域极其狭窄，栖息地多为山地，景色宜人，夏季凉爽，有部分爪鲵分布区为开发旅游资源而建立风景区，这在很大程度上对爪鲵生境造成了干扰和破坏。建议加强爪鲵物种监测和栖息地保护力度，对爪鲵分布区实施封闭管理，目前，辽宁鞍山市野生动植物保护站建立了爪鲵自然保护小区[23]。同时，需进一步加强爪鲵生物学、种群遗传学以及保护生物学研究，为爪鲵保护提供科学的理论指导。

4 结论

Cytb分析两种爪鲵种群遗传变异水平很低，但吉林爪鲵的遗传多样性高于辽宁爪鲵。辽宁爪鲵种群间存在较小遗传分化，而吉林爪鲵种群间均无遗传分化。辽宁爪鲵和吉林爪鲵种群均呈现多系的谱系结构，建议将两个物种分别作为一个管理单元加以保护。

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