HPLC法同时测定五加生化胶囊中阿魏酸和槲皮素的含量

高松红，单柏宇，徐 阳，鲍慧玮

(1.长春医学高等专科学校，吉林长春 130000；2.白城市食品药品检验所，吉林白城 137000； 3.长春中医药大学，吉林长春 130117)

[通讯作者]鲍慧玮(1989- )，女，实验师，硕士，从事中药质量控制及药效学研究。

五加生化胶囊收载于《国家药品标准-新药转正标准》第33册，主要由刺五加浸膏、当归、川芎、桃仁、干姜、甘草组成，其中刺五加和当归为君，具有益气复原、祛瘀生新和养血活血的作用；桃仁和川芎为臣，具有活血化瘀的作用；干姜为辅，具有止痛止血的作用。多味药联合起效，对于产后、经期、人流后气虚血瘀所至阴道流血的症状，具有良好的药效作用[1]。

阿魏酸(图1)是当归和川芎中主要的有效成分之一。阿魏酸具有调节人体生理机能[2-7]，抗血小板聚集，增强前列腺素活性，镇痛、缓解血管痉挛等作用[8]，是治疗心脑血管疾病、白细胞减少等疾病药品的基本原料[9-10]。槲皮素(图2)主要来源于刺五加，具有祛痰、止咳、平喘；抗菌、抗炎；清除自由基、抗氧化、抗肿瘤，抑制血小板凝结、抗动脉粥样硬化等作用[11-12]。槲皮素具有较强的抑制血小板活化因子(PAF)的作用[13-14]，能明显地抑制凝血酶诱导的兔血小板3H-5-HT释放[15]。现五加生化胶囊质量控制主要依据《国家药品标准-新药转正标准》，对异嗪皮啶的含量进行测定，但单一成分的测定并不能准确反映五加生化胶囊的质量，故本文选取当归中主要药效成分阿魏酸和刺五加中主要黄酮类成分槲皮素进行测定，给整体控制五加生化胶囊质量提供参考。

图1 阿魏酸

图2 槲皮素

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC2030型高效液相色谱仪(日本岛津有限公司)；RE 52-99旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；AVW20D型电子天平(日本岛津有限公司)；KQ-400KDE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

槲皮素对照品(批号：100081-201408，中国药品生物制品检定所)；甲醇(色谱纯，美国FISHER公司)，无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、磷酸(分析纯，北京化工厂)，水(纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司)。五加生化胶囊(规格0.4g/粒，批号：1603011，多多药业有限公司)。

1.2 混合对照品溶液的配制

精确称量阿魏酸和槲皮素对照品适量于10 mL量瓶中，加适量甲醇超声溶解，甲醇定容至刻度，超声10 min，即配制成0.5 mg/mL的阿魏酸和槲皮素的对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，得混合对照品溶液。

1.3 供试品溶液的配制

取5 g五加化胶囊内容物，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50 mL，超声处理30 min，过滤，重复三次试验，合并滤液。将滤液置旋转蒸发仪中蒸干，加适量甲醇超声溶解，用5 mL容量瓶定容至刻度，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：Diamonsil C18(4.6×250 nm，5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(46∶54，V/V)；柱温：40 ℃；流速：1.5 mL/min；检测波长：360 nm；进样量：10μL。理论塔板数按阿魏酸和槲皮素计算均不低于2000，且阿魏酸、槲皮素与其它物质分离度均大于1.5，符合《中国药典》规定。实验结果见图3。

1.阿魏酸；2.槲皮素(A为空白色谱图；B为对照品色谱图；C为供试品色谱图)图3 HPLC色谱图

2.2 线性关系考察

分别精密称取阿魏酸、槲皮素对照品20.32 mg、3.67 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，即得2.032 mg/mL的阿魏酸和0.367 mg/mL的槲皮素混合线性对照品母液。分别精密吸取0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL的混合对照品母液置5 mL量瓶中，定容至刻度，即0.2032、0.4064、0.6096、0.8128、1.016 mg/mL的阿魏酸和0.0367、0.0734、0.1101、0.1468、0.1835 mg/mL的槲皮素线性对照品溶液。按照2.1中的条件，将母液与配制的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱峰面积。以色谱峰面积为纵坐标(y)，对照品浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。得到阿魏酸的回归方程为y=26574x+10.83，r=0.9996(n=6)，在0.2032～2.032 mg/mL范围内呈良好的线性关系。槲皮素的回归方程为y=5362x+18.3，r=0.9996(n=6)，在0.0367～0.367 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验

按照2.1中的条件分别精密吸取混合对照品溶液和五加花胶囊供试品溶液(批号：1603011)各10μL，连续进入高效液相色谱仪6次，测得槲皮素标准品、阿魏酸标准品和供试品中槲皮素、阿魏酸色谱峰面积的RSD值分别为0.83%、0.21%、1.48%和1.01%，结果表明此方法精密度良好。

2.4 稳定性考察

分别在0，2，4，6，8，10，12，24 h时，按照2.1中的条件测定槲皮素标准品、阿魏酸标准品和五加生化胶囊供试品(批号：1603011)中槲皮素、阿魏酸的峰面积，计算RSD值，分别为0.11%、0.76%、1.87%和1.40%(n=8)，结果表明，混合对照品溶液和供试品溶液中阿魏酸、槲皮素具有良好的稳定性。

2.5 重复性实验

取五加生化胶囊(批号：1603011)内容物6份，每份约5 g，精密称量，按1.3制备供试品溶液，依法进行含量测定，测得槲皮素和阿魏酸色谱峰面积，并计算出其含量的RSD值为1.87%和1.65%，结果表明此方法重复性良好。

2.6 加样回收率实验

取6份阿魏酸标准品，每份约5 mg，分别置于1 mL容器中，适量甲醇溶解，定容至刻度，即浓度约为5 mg/mL的阿魏酸标准品溶液。分别吸取0.5 mL 5 mg/mL的阿魏酸标准品溶液置于6份约2.5 g的五加生化胶囊(批号：1603011)内容物中，常温下甲醇挥干。按照1.3项供试品配制方法进行制备，进行含量测定和回收率计算。平均回收率为100.62%，RSD值为0.83%，结果见表2。取6份槲皮素标准品，每份约7.5 mg，分别置于2 mL容量中，适量甲醇溶解，定容至刻度，即浓度约为3.75 mg/mL的槲皮素标准品溶液。分别吸取0.1 mL 3.75 mg/mL的阿魏酸标准品溶液置于6份约2.5 g的五加生化胶囊(批号：1603011)内容物中，常温下甲醇挥干。按照1.3项供试品配制方法进行制备，进行含量测定和回收率计算。平均回收率为99.52%，RSD值为1.23%，结果见表3。综上表明此方法回收率良好。

表2 阿魏酸加样回收率测定结果

表3 槲皮素加样回收率测定结果

2.7 样品测定

取不同批号的五加生化胶囊样品，按照1.3项制备供试品溶液，分别精密吸取1.2项混合对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪中，依法进行含量测定，记录色谱峰面积，并按照外标法计算供试品中阿魏酸和槲皮素的含量，结果见表4。

表4 同批五加生化胶囊内容物中槲皮素和阿魏酸的含量测定结果

3 讨论

通过对比超声提取法、热回流提取法、浸渍法和索氏提取法对五加生化胶囊中阿魏酸和槲皮素的提取效果，最终确定热回流提取法和超声提取法具有较好的提取效果，但由于超声提取法更为简便，利于供试品的配制，最终确定超声提取法为最佳的提取方法。通过对比不同极性试剂对五加生化胶囊中阿魏酸和槲皮素的提取效果，最终确定无水乙醇和甲醇为最佳的提取溶剂，由于无水乙醇的毒性较小，故选择无水乙醇为提取溶剂。本实验从提取时间、提取次数、料液比三个方面综合考察提取方法，最终确定取4 g五加生化胶囊加无水乙醇50 mL，超声处理30 min，提取3次为最佳的供试品制备方法。

通过对比不同流动相体系、不同流动相比例、不同色谱柱温度和不同的流速，最终确定在甲醇-0.1%磷酸水溶液(46∶54，V/V)，柱温40℃，流速1.5 mL/min时阿魏酸和槲皮素与其它色谱峰具有良好的分离效果，且时间长度适宜。在检测波长选择方面，对比不同的检测波长，最终确定360 nm下，供试品中阿魏酸和槲皮素具有良好的吸收，且分离度良好。

五加生化胶囊具有良好的药效，在治疗多种疾病方面具有重要作用。现其质量控制方法主要依据《国家药品标准-新药转正标准》，对其中异嗪皮啶的含量进行测定。对于中药复方药，以其中一种成分来评价其质量的优劣并不科学，其药效作用主要是多组分联合起效。阿魏酸为当归中的主要药效成分和药典中的指标性成分，槲皮素为刺五加中的主要黄酮类成分，它们具有多种药效作用，且与五加生化胶囊药效相符，故本实验选取它们为指标性成分。此方法完善了五加生化胶囊的质量评价方法，为其质量控制奠定研究基础。

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