“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗死性痴呆大鼠空间记忆的影响

罗本华 郭雅雯 彭敏家 张亚飞 王 燕 覃斌宁

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

记忆减退、认知障碍等为血管性痴呆(VD)核心症状。神经行为学实验常用于评估这种认知功能的情况，“益气调血、扶本培元”药线灸法是基于“三焦气化失司理论”阐释老年期痴呆的发病观〔1〕、病机观〔2〕及治疗观〔3〕，“益气调血、扶本培元”针法多年临床与实验研究〔4〕、取穴优选组方〔5〕，结合特色的壮医药线灸刺激新创的一种老年期痴呆灸疗新法；已取得其改善VD患者症状和认知功能〔6，7〕的证据，动物实验证实其改善多发梗死性痴呆(MID)模型大鼠中枢海马乙酰胆碱(ACh)、Ach酯酶(AChE)与胆碱乙酰转移酶(ChAT)含量〔8〕的作用，提出其可能通过中枢ACh信息传递和信号转导起作用的假设机制。本实验观察“益气调血、扶本培元”药线灸法对MID大鼠神经行为学的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 健康SPF级Wistar雄性大鼠100只，体重(280±20)g，由广西医科大学动物实验中心提供；室内温度18℃～22℃，相对湿度45%，室内采光按照白昼循环模式，标准粒饲料定时喂养，自由饮水，适应性喂养15 d。仪器为Eppendorf research plus单道可调整支消毒移液器(10 μl、200 μl及1 000 μl，编号：3120000)，12号弯锡灌胃针(GWL-12W)，TM-vision行为学实验系统(成都泰盟软件有限公司)。

1.2动物分组 采用随机数字表法将大鼠随机分为正常组10只、假手术组10只和预用栓子造模组80只；栓子造模组在经过MID造模成功53只入选，Morris水迷宫筛选，剔除不符合痴呆标准(8只)及死亡(5只)，最后入选40只，随机分为模型组、药线灸组、药物组和药线非穴组各10只。

1.3MID造模方法〔9〕取同种大鼠股动脉采血，无菌条件下于37℃温箱内自然干燥24 h，用100目筛子过筛，制备200 μm以下的血凝块备用。应用时每10 mg血栓加0.3 ml生理盐水制成混悬液。3.5%水合氯醛按35 mg/100 g体重腹腔麻醉。颈正中切开皮肤(约1 cm)，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，暴露颈外动脉，分离颈外动脉上两分支，避开两分支，分别在颈外动脉上备2根手术缝合线，结扎远心端，近心端先套一活结。用儿科4号头皮针针头逆行穿刺右颈外动脉至右颈内动脉起始处，随即用1 ml注射器缓慢(60～90 s)注入栓子盐水悬液0.3 ml，使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成多灶性脑梗死，然后结扎颈外动脉，缝合皮肤。切口处滴注庆大霉素抗感染。假手术组手术方法同模型制作，只是注射时以生理盐水0.3 ml代替栓子溶液。

1.4模型筛选 栓子造模组于造模后7 d进行Morris水迷宫隐蔽平台试验，连续训练5 d，2次/d。取第5天正常组逃避潜伏期均值为参考值，同时计算栓子造模组第5天平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比值，该值>20%定为痴呆鼠。符合痴呆条件的动物待用。

1.5干预方法及疗程 干预方法：模型组给予药线灸组相同时间、相同程度的捉抓刺激。药物组于造模并痴呆筛选后将1 mg·kg-1·d-1盐酸多奈哌齐溶于2 ml生理盐水中灌胃，于每日早晨8：00灌胃。药线灸组治则与取穴，与“益气调血、扶本培元”针法相同。药线灸操作方法：按《壮医药线灸疗法》采用2号药线(直径0.5 mm)，轻刺激手法点灸，按“先上后下、先躯干再四肢、先阳后阴：次序点灸以上相应腧穴各1壮。药线非穴组选取双侧肋下2个固定非穴点，针刺双侧肋下各两个固定非穴点〔9〕，约相当于乳正中线外开2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；作为对照刺激点，轻刺激手法药线灸左3右4壮，或左4右3壮，交替。假手术组给予药线灸组相同时间、相同程度的捉抓刺激。正常组给予药线灸组相同时间、相同程度的捉抓刺激。疗程：各组每天做相应处理1次，第8、16天各停1次，连续21次治疗。

1.6行为学实验方案测试 Morris水迷宫参照文献制作〔10，11〕由图像自动采集和分析系统(成都泰盟软件有限公司，TM-vision行为学实验系统)自动分析和处理，包括动物的逃避潜伏期、游泳路径、穿越原平台的次数、游泳路线的长度等参数。水迷宫实验方法与操作参考文献〔11〕。除探索试验记录大鼠在60 s内外，其余每次水迷宫时间均设90 s。水迷宫实验在针刺等干预后次日进行；实验程序包括第1～2天共2 d的隐蔽平台试验，第3天为探索试验，第4～6天共3 d反向试验及第7天的可视平台试验。取每天两次检测的平均潜伏期时间均值为学习成绩；以评价各组学习记忆能力变化。

1.7统计学方法 采用SPSS16.0软件进行方差分析及组间两两比较，方差齐时选用LSD法检验，方差不齐时选用DunnettT3法检验。

2 结 果

2.1隐蔽平台试验 模型组平均潜伏期下降缓慢而正常组下降明显，于第2天，组间出现显著性差异(P=0.016)；模型组平均潜伏期较正常组显著长，也较假手术组显著长，但假手术组与正常组无差异；药线灸组较模型组、非穴组均明显缩短，而药物组没有出现这种显著性差异。见图1和表1。

2.2反向试验 在连续3 d的反向试验中，正常组和模型组逃避潜伏期时间均随训练天数的增加而逐渐下

降，再学习成绩稳步提高，反映针刺治疗和水迷宫的训练显著性改善再学习和记忆作用(P<0.01)；训练天数与组间因素之间没有交互作用(P>0.05)。各天组间因素两两比较发现：模型组平均逃避潜伏期时间下降缓慢而正常组下降显著；第4天组间比较出现显著性差异(P<0.05)，模型组平均逃避潜伏期时间显著高于正常组(P<0.01)和假手术组(P<0.05)，药线灸组和药物组均显著性低于MID模型组(P<0.05)，而药线灸组又显著性低于非穴组(P<0.05)；此后2 d，第6天药物组与模型组无显著性差异，表现作用不稳定，药物组和药线炙组无显著性差异。见图1和表1。

图1 6组隐蔽、反向及可视平台试验的平均逃避潜伏期趋势

2.3空间探索试验 各组空间探索试验平均潜伏期有非常显著性差异(P<0.01)。模型组比正常组穿越原平台次数明显减少(P<0.01)；药物组虽较模型组能增加穿越原平台次数，但无统计学意义；而药线灸组穿越原象限平台次数明显增加，且分别比模型组、药物组及非穴组差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

2.4可视平台试验 平均逃避潜伏期时间方面，6组差异无统计学意义(P>0.05)；平均运动速度方面，6组差异无统计学意义(P>0.05)。见图1和表1。

表1 6组水迷宫中平均逃避潜伏期时间

与正常组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与药线灸非穴组比较：5)P<0.05，6)P<0.01；与药物组比较：7)P<0.05

3 讨 论

VD临床以认知功能障碍症候为核心症状，兼有一些局灶性神经系统症状、神经心理症状和精神行为异常。动物研究常采用神经行为学实验来检测这种认知功能状况。本实验提示各组大鼠在感觉或运动功能方面均无显著差异，不对空间学习记忆产生显著性差异，提示该实验具有可比性。药线灸法有疗效优势。药线灸方法较药物治疗是更合适和更优选的方法，为进一步深入可能的通过中枢ACh信息传递及信号转导的作用机制假说研究提供了铺垫；药线灸方法是较西医金标准药物多奈哌齐治疗是更佳和更适宜的方法，原因或与壮医药线灸法显示的多途径、多靶点和多层次作用有关，综合改善VD认知功能障碍作用是其取效的关键，这正是单一靶点金标准药物所不具备的，多奈哌齐治疗不可避免有其局限性、单一靶点性及副作用。

4 参考文献

1罗本华，赵 岚，成海燕，等.论老年期痴呆是生命气化阶段性异常病变〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(13)：3791-5.

2罗本华，成海燕，赵 岚，等.论生命气化阶段性失常是衰老病机之长〔J〕.辽宁中医杂志，2012；39(12)：2391-4.

3罗本华，于建春，成海燕，等.论三焦气化是脑神的基础〔J〕.辽宁中医杂志，2010；37(6)：1004-7.

4罗本华.“益气调血、扶本调源”针法治疗血管性痴呆研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(14)：4091-2.

5罗本华，张雪竹，赵 岚，等.三种针法对快速老化痴呆模型小鼠老化评分及行为学影响研究〔J〕.环球中医药，2013；6(3)：165-71.

6罗本华，于建春，吴跃强，等.“益气调血、扶本调源”药线灸疗法治疗轻中度血管性痴呆30例〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(11)：3134.

7罗本华，于建春，胡跃强，等.“益气调血、扶本培源”药线灸治疗轻中度血管性痴呆临床观察〔J〕.时珍国医国药，2015；26(3)：649-51.

8罗本华，罗梅桂，张亚飞，等.“益气调血、扶本培元”药线灸对多发梗塞性痴呆大鼠海马乙酰胆碱、乙酰胆碱脂酶与乙酰胆碱转移酶含量影响的研究〔J〕.中国老年学杂志，2016；37(8):4467-9.

9Liu CZ，Yu JC，Cheng HY，etal.Spatial memory performance and hippocampal neuron number in osteoporotic SAMP6 mice〔J〕.Exp Neurol，2006；201(2)：452-60.

10Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat〔J〕.Neurosci Meth，1984；11(1)：47-50.

11Yu J，Liu C，Zhang X，etal.Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats〔J〕.Physiol Behav，2005；86(4)：434-41.