同位素内标液质联用法测定动物源食品中的氯丙嗪残留量

吴基任 李成 谭高好 莫秋岸 徐彬

摘 要 建立测定动物源食品中氯丙嗪（Chlorpromazine）残留量的液相色谱串联质谱同位素内标方法。样品用乙腈和水（80/20）超声波提取后，用Waters Oasis PRiME HLB小柱净化，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离。以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，用电喷雾正离子（ESI+）多反应监测、基质校准同位素内标法进行定量分析。方法在0.1～20 μg/L范围内具有良好线性，相关系数r=0.998。样品在低、中、高3个浓度水平下的平均回收率为89.1%～93.5%，相对标准偏差（RSD）为2.5%～4.8%。检出限（S/N=3）为0.1 μg/kg，定量下限（S/N=10）为0.3 μg/kg。

关键词 超高效液相-串联质谱 ；同位素内标 ；氯丙嗪 ；动物源食品

中图分类号 O656.31 文献识别码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.021

Abstract Chlorpromazine residues in animal-based food were detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and quantified by using an isotope-labeled internal standard. The samples were extracted by acetonitrile and water （80/20）， purified by Waters Oasis PRiME HLB column， separated by Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column. The acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution were used as the mobile phase for gradient elution. The chlorpromazine was detected by using electrospray ionization （ESI+） in positive ion mode with multiple reaction monitoring （MRM）， and its quantity was analyzed by using the matrix matched calibration method combined with the stable isotope-labeled internal standard. This combined method had a good linearity in the range of 0.1～20 g/L， and its correlation coefficient was r=0.998. The mean recoveries of spiked samples at three levels （low， moderate and high） ranged from 89.1% to 93.5% with relative standard deviations （RSD） of 2.5%～4.8%. The detection limit （S/N=3） was 0.1 g/kg， and the lower limit of quantitation （S/N=10） was 0.3 g/kg.

Keywords supper-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ； isotope-labeled internal standard ； chlorpromazine ； animal-based food

氯丙嗪（Chlorpromazine）是一種吩噻嗪类药物，在临床上作为中枢多巴胺受体的阻断剂，作用于中枢神经系统，常用来镇吐、镇静催眠以及抗晕眩、晕动症等[1-2]。因经济利益的驱使，一些养殖户在饲料中违规添加氯丙嗪来抑制家畜的运动，以达到育肥的目的；或是在家畜的长途运输过程中使用氯丙嗪，以减轻动物的应激性，降低死亡率[3-5]。氯丙嗪在家畜饲养中的滥用，会通过动物性食品的残留直接危害到人类健康[6-9]。卫生部于2010年3月22日公布的第四批“食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单”中就包含了氯丙嗪。而且我国农业部235公告明确规定了氯丙嗪等精神类药物只允许治疗使用，且不得在动物性食品中检出[10]。目前现行有效的氯丙嗪残留检测方法为GB/T 20763-2006，适用基质是猪肾和肌肉组织[11]，根本无法满足现在的要求，且该方法前处理过于复杂，实际应用中氯丙嗪加标回收率偏低[12]。因此建立简单准确的动物性食品中氯丙嗪的检测方法，给食品风险预警和食品安全监管提供技术支撑势在必行[13-14]。本研究分析了前处理方法和色谱条件等对动物性食品中氯丙嗪残留量同位素内标液质联用法检测效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和设备

LC-30超高效液相（日本岛津），QTRAP 5500三重四级杆液质（美国AB SCIEX），SK7200B超声波清洗器（上海科导），T-18均质机（IKA广州），Multi Reax全能型振荡器（德国Heidolph），Centrifuge 5804高速离心机（德国Eppendorf），DG-12型固相萃取装置（美国Supelco）；Autovap S60氮吹仪（美国ATR），XS-205电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo），Milli-Q超纯水制备系统（美国MILLI-PORE）。

1.1.2 试剂和样品

盐酸氯丙嗪标准品（德国Dr.Ehrenstorfer），盐酸氯丙嗪-D6同位素内标（德国Dr.Ehrenstorfer），乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，德国默克公司），Waters Oasis PRiME HLB小柱：200 mg/6 mL（美国Waters），实验用水为超纯水，样品为农贸市场不同摊位采购的猪肉、牛肉、羊肉各10批。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

将样品切成小块后用匀浆机粉碎，称取5 g样品于50 mL离心管中，添加氯丙嗪-D6内标溶液，漩涡混匀；加入10 mL 80%乙腈水溶液，漩涡混匀2 min，置于超声波清洗器超声提取10 min，10 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液直接加载到Waters Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，保持1滴/s的流速，收集全部流出液；在40℃下氮气吹至近干，用10%甲醇水溶解定容至2 mL，过0.22 μm微孔滤膜，上LC-MS/MS测定[15]。

1.2.2 标准溶液的配制

准确称取盐酸氯丙嗪标准品、盐酸氯丙嗪-D6同位素内标，用甲醇配制成10 μg/mL标准储备液，用甲醇将标准储备液稀释成100 μg/mL标准工作液。

1.2.3 仪器分析条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters Acquity UPLCTM BEH C18 1.7 μm，2.1×100 mm。

流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：2 μL。梯度洗脱程序见表1。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测（MRM）；电喷雾电压（IS）：5 500 V；离子源温度：550℃；雾化气压力（GS1）：50 psi；气帘气压力（CUR）：20 psi；辅助气压力（GS2）：50 psi。质谱参数条件见表2。

2 结果与分析

2.1 样品处理的优化

畜肉基質复杂，含有大量的蛋白质、脂肪及非极性磷脂类干扰物，极大地干扰目标化合物的分析，这就要求前处理必须能够净化畜肉的复杂基质，同时释放出目标化合物。试验使用不同浓度的乙腈溶液处理样品，提取目标化合物，同时起到沉淀蛋白的目的。试验比较了70%、80%、90%乙腈水溶液及纯乙腈溶液提取效率和净化效果，发现含80%乙腈水溶液提取效率最高。在固相萃取小柱的选择上，选取了Waters Oasis HLB （200 mg/6 mL）和Waters Oasis PRiME HLB（200 mg/6 mL）进行比较，这2种固相萃取小柱均无需活化、淋洗及洗脱。而Waters Oasis PRiME HLB作为增强型除磷脂等非极性干扰物的新型反相SPE吸附剂，结合80%乙腈水溶液作为提取液沉淀蛋白，能够有效地除去畜肉样品中的大部分基质干扰，获得更干净的样品谱图及准确分析结果，2种固相萃取小柱对猪肉、牛肉、羊肉3种阴性基质的净化效果见下图1和图2。

2.2 色谱流动相的条件的优化

采用乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，将空白基质配制的1 ng/mL标准溶液进样测试，比较出峰情况，发现流动相水相加入5 mmol/L乙酸铵，可以改善色谱峰拖尾的问题，但存在响应值偏低的问题，而乙腈-0.1%甲酸水溶液则有利于化合物的离子化，信号响应得到增强。综合考虑基质干扰、灵敏度、峰型等因素，选取乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相。氯丙嗪及D-6氯丙嗪总离子流图及二级质谱图见图3和图4。

2.3 方法的线性范围和检出限

精确吸取氯丙嗪标准溶液、D6-氯丙嗪内标溶液，用处理好的阴性样品溶液稀释，配置成2 ng/mL的D6-氯丙嗪内标，氯丙嗪为0.1、0.5、2、5、10、20 ng/mL的标准系列。按优化好的仪器条件对标准系列进行测定，以目标化合物定量离子的峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，ng/mL）为横坐标绘制工作曲线，得到线性回归方程：Y= 18.116 72X-0.205 02，相关系数r =0.998，表明目标化合物在相应的浓度范围内线性关系良好。在阴性样品中添加一定量的氯丙嗪及D6-氯丙嗪，按1.2.1处理后上机测定，根据定量离子对色谱峰的信噪比[其中信噪比（S/N=3）为检出限，信噪比（S/N=10）为定量下限]，得出该方法检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg。

2.4 方法的准确度和精密度

取阴性猪、牛、羊肉，分别添加0.5、2、10 μg/kg 3个水平的加标试验，每个水平进行6个平行试验，以考察方法的准确度，结果见表3。从表中可知，氯丙嗪在猪、牛、羊这3种基质中的3个水平加标，回收率在89.1%～93.5%，相对标准偏差RSD（n=6）在2.5%～4.8%，符合GB/T 27404-2008 《实验室质量控制规范 食品理化检测》标准附录F中F.1回收率的要求（被测组分含量<0.1 mg/kg时，回收率范围为60%～120%）及标准附录F中实验室内变异系数的要求[相对标准偏差RSD（n=6）<10%]。

2.5 实际样品检测

采用本方法对市场采购的10批共30份猪肉、牛肉、羊肉样品进行检测，其中仅有1份猪肉检出略低于检出限（0.07 μg/kg）的氯丙嗪，牛肉、羊肉中未检出，结果见表4和图5。

3 讨论

本实验采用80%乙腈-水溶液超声涡旋提取，建立了同位素内标液质联用法测定畜肉中氯丙嗪的方法。针对猪肉、牛肉、羊肉等3种基质的阴性样品，通过加标回收、精密度和市场采购试样的测试结果可知，该方法前处理操作简便、快速，净化效果好，精密度和准确度高，检测灵敏度优于现行有效的国标方法，很适用于大批量畜肉样品中氯丙嗪的监测。

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