Smad真核表达质粒构建及其在小鼠T淋巴瘤细胞中的表达

王婧帆，季然，李鑫宇，陈金铃(南通大学医学院病原生物学系，江苏南通226000)

Smad同源蛋白在将转化生长因子β1(TGF-β1)信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起关键作用，且不同的Smad蛋白介导不同家族成员的信号转导[1]。TGF-β1通过与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，诱导Smad2和Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2、Smad3与Smad4形成蛋白复合物，进入细胞核内调节靶基因的转录[2]。TGF-β1能通过诱导Smad蛋白调节叉头/翼状螺旋转录因子3(Foxp3)的表达，因此TGF-β/Smad信号通路与Foxp3的表达密切相关。Foxp3是调控调节性T细胞发育及功能的关键性转录因子[3]。Foxp3依靠其叉头样结构和DNA结合，并停留在细胞核内[4]。由于Foxp3的DNA结合域靠近蛋白C端，能抑制基因转录。因此，Foxp3能不同程度减少白细胞介素2(IL-2)、IL-4等细胞因子的转录活性[5]。Foxp3基因突变可引起scurfy(sf)突变小鼠中X-连锁的淋巴细胞增生性疾病，而在人类中的突变可导致调节性T细胞的缺陷，导致免疫调节失调-多(种)内分泌病-肠病-X-连锁综合征[6]。Smad蛋白尤其是Smad3蛋白，作为TGF-β信号转导器，参与调节TGF-β的活性[5]。有研究结果显示，Smad3缺失导致Smad3-/-小鼠炎症反应增强，同时伴有Th2和Th17型免疫应答减弱，小鼠淋巴结中Foxp3的mRNA表达下调[6]。Tardif等[7]观察到Foxp3增强子与转录因子Smad3、活化T细胞核因子(NFAT)结合，提示TGF-β可能通过此位点实现对Foxp3的转录调节。2016年4月～2018年3月，本研究构建并鉴定pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3和pcDNA3.1-Smad4真核表达质粒，探讨Smad真核表达质粒在小鼠T淋巴瘤细胞(EL4)中是否能稳定表达，为进一步探究Smad蛋白调控Foxp3表达的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 EL4细胞购自中国科学院细胞库；Smad2购自Santa Cruz Biotechnology；Smad3、Smad4购自Cell Signaling Technology；大肠杆菌DH5α、pcDNA3.1真核表达载体、pMD19-T载体、T4连接酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒及DNA marker均购自大连TaKaRa公司；Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ及Xho Ⅰ等限制性内切酶均购自中国Fermentas公司；电转液购自北京Engreen Biosystem公司；电击杯购自美国BTX公司。

1.2 Smad2、Smad3、Smad4基因扩增与克隆 采用PCR技术。根据GenBank的Smad2、Smad3、Smad4基因组序列，分别设计相应的特异性引物，扩增Smad2、Smad3、Smad4基因。Smad2上游引物：5′-AAGCTTGCCACCATGTCGTCCATCTTGCCATTC-3′，下游引物：5′-GAATTCTTTGCTCTGGAATTTTTGGATAG-3′；Smad3上游引物：5′-GAATTCGCCACCATGTCGTCCATCCTGCCCTTC-3′，下游引物：5′-CTCGAGCCTGGGGTTTTCTTCTGTGGTC-3′；Smad4上游引物：5′-GAATTCGCCACCATGGACAATATGTCTAT-AACAAATACAC-3′，下游引物：5′-CTCGAGTCAGTCTAAAGGCTGTGGGTC-3′。以EL4细胞获得的cDNA为模板，通过PCR反应扩增出目的基因Smad2、Smad3、Smad4。PCR反应总体系为50 μL，引物各1.5 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，60 ℃复性30 s，68 ℃延伸1 min，循环25次后68 ℃延伸30 min。PCR产物加“A”尾反应，72 ℃反应30 min，经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，目的片段按照DNA胶回收试剂盒说明书切胶回收。

1.3 pMD19-T载体构建 制备DH5α感受态，PCR产物与pMD19-T载体经T4 DNA连接酶连接过夜。反应体系总体积为10 μL，其中目的片段4 μL，pMD19-T 1 μL，Solution Ⅰ 5 μL。第2天取连接产物，转化DH5α感受态细胞，于37 ℃倒置培养过夜，挑取单克隆菌落至LB液体培养基，37 ℃摇菌过夜，进行菌液PCR。挑选PCR结果阳性的菌液抽提质粒DNA进行鉴定。重组质粒置37 ℃水浴2 h，分别进行单酶切和双酶切验证。产物经琼脂糖凝胶电泳检测，验证正确后，送由上海生工生物工程股份有限公司测序并通过DNAMAN软件分析测序结果。

1.4 表达载体pcDNA3.1的构建 将pMD19-T重组质粒和pcDNA3.1质粒分别用限制性内切酶Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ进行双酶切，置于37 ℃水浴2 h，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。纯化获得的酶切后的目的片段和pcDNA3.1载体通过T4连接酶连接，16 ℃反应过夜，反应体系：pcDNA3.1 1 μL，目的片段6 μL，5×T4 DNA ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 1 μL。连接产物转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定为阳性的克隆通过双酶切进行验证后，由上海生工生物工程股份有限公司测序并通过DNAMAN软件分析测序结果。

1.5 转染 将EL4细胞调整至5×106/mL，加入2 μg构建好的pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4过表达质粒，电转液(100 μL)吹打混匀，电转仪电转后置37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h。

1.6 EL4细胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表达检测 采用Western blotting法。转染后72 h，收集EL4细胞置EP管中，离心弃上清，PBS重悬细胞，离心弃上清。加入蛋白裂解液100 μL，冰上裂解20 min。细胞经超声破碎后，离心收集上清，检测蛋白浓度。加入5×上样缓冲液，沸水中煮沸10 min，置于-20 ℃冰箱备用。配制10%的分离胶，行电泳。转膜后用10%脱脂牛奶封闭PVDF膜，室温2 h。Smad2按1∶200稀释，Smad3、Smad4 按1∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜。二抗1：5 000稀释，室温孵育1 h。TBST充分洗膜后，ECL显影。

2 结果

2.1 重组质粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4鉴定结果 图1A显示，4号泳道上可见两条清晰的条带，其中一条与pcDNA3.1空载体(5 428 bp)的大小一致，另一条带与第5泳道的PCR产物(Smad2)大小一致，提示pcDNA3.1-Smad2重组质粒构建成功。图1B显示，4号泳道上可见两条清晰的条带，其中一条带与pcDNA3.1空载体(5 428 bp)的大小一致，另一条带与第5泳道的PCR产物(Smad3)大小一致，提示pcDNA3.1-Smad3重组质粒构建成功。图1C显示，4号泳道上可见两条清晰的条带，其中一条条带的大小与PCR产物(Smad4)的大小一致，提示pcDNA3.1-Smad4重组质粒构建成功。测序结果证实插入的Smad2、Smad3、Smad4无突变。

注：M1为λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker；1为pcDNA3.1质粒；2为pcDNA3.1-Smad重组质粒；3为pcDNA3.1-Smad重组质粒经EcoR Ⅰ单酶切产物；4为pcDNA3.1-Smad重组质粒双酶切产物；5为菌液PCR产物；M2为DL2000 DNA Marker。

图1Smad真核表达质粒鉴定结果

2.2 EL4细胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表达变化 将构建成功的pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4质粒转染至EL4细胞72 h后，EL4细胞中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达上调。见图2。

注：A为Smad2蛋白表达；B为Smad3蛋白表达；C为Smad4蛋白表达。

图2EL4细胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表达

3 讨论

Smad蛋白最早从果蝇及线虫基因筛查中鉴定出来[8,9]，是TGF-β家族受体下游的信号转导分子。根据Smad蛋白在TGF-β信号转导中的功能差异，分为受体调控Smad(R-Smad1/2/3/5/6)、通用Smad(Co-Smad4)及抑制型Smad(I-Smad6/7)。R-Smad能够与受体结合并被受体磷酸化而激活；Co-Smad能够与活化的R-Smad结合形成复合物，复合物进入细胞核结合DNA，与多种转录辅因子相互作用共同调控基因转录；I-Smad 作为R-Smad的竞争性抑制子，能负性调控TGF-β信号通路。经典的Smad信号通路通过TGF-β与丝氨酸/苏氨酸激酶Ⅰ型和Ⅱ型受体结合发挥效应。Ⅰ型受体激酶上游存在一个富含甘氨酸/丝氨酸的G 序列，TGF-β与Ⅱ型受体结合从而磷酸化Ⅰ型受体GS区，GS区的磷酸化随之活化Ⅰ型受体，活化的Ⅰ型受体继而磷酸化R-Smad C末端的SXS基序中的丝氨酸。活化的R-Smad与Smad4形成蛋白复合物，随后转入细胞核内，与不同的Smad结合原件、DNA转录因子、转录共激活剂或共抑制剂结合，从而实现对靶基因的调控[10]。

Foxp3是调控调节性T细胞发育及功能的关键性的转录因子。TGF-β1通过诱导Smad蛋白调节Foxp3的表达[11]。有研究证实，TGF-β诱导的转录因子Smad3和NFAT协同作用，与Foxp3内含子中的增强子元件相结合实现对Foxp3的调控。Smad3是TGF-β1信号通路的近端分子，在Foxp3的表达中起主要作用。在野生型小鼠中TGF-β1是T细胞表达Foxp3的一个有效的诱导剂；在Smad3敲除小鼠中，Foxp3+T细胞明显减少[12]。因此，Smad3在TGF-β1诱导的Foxp3的产生过程中起重要的调节作用[13]。在之前的研究中，Smad3和Smad4已被证实能调节由TGF-β诱导的调节性T细胞，但在Th17细胞的产生中作用不大[7]。当Smad2缺失时，TGF-β诱导的Foxp3的表达会急剧减少。小鼠脾细胞经细粒棘球蚴囊液处理后，细粒棘球蚴囊液能上调对小鼠脾脏细胞中Treg相对特异分子Foxp3的表达，而下调TGF-β1的下游信号通路Smad4的表达，两者之间呈负相关[14]。外周血中，Smad7和Foxp3水平能提示慢性移植肾肾病的发展程度，是检测慢性移植肾肾病的一个无创指标。Smad7可能通过某种机制调控Foxp3的表达。

本研究将提取的重组质粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3及pcDNA3.1-Smad4分别用限制性内切酶双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。结果重组质粒经双酶切后可见2条清晰条带，一条与目的片段的大小一致，另一条与pcDNA3.1空载体的大小一致，提示构建的重组质粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4中有目的片段插入。DNA测序及比对结果表明，重组质粒pcDNA3.1-Smad2，pcDNA3.1-Smad3和pcDNA3.1-Smad4中的插入片段序列与目的基因的CDS区序列完全相同，进一步说明成功构建Smad2、Smad3、Smad4高表达载体。且将Smad真核表达质粒成功转染入EL4细胞后，能诱导目的蛋白高表达。本研究为进一步探究Smad蛋白调控Foxp3表达的机制奠定了基础。

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