线粒体融合基因2抑制骨肉瘤及其干细胞增殖功能分析对其转移机制的影响

徐斌武，李 晨

(南昌大学第二附属医院骨科，江西 南昌 330000)

骨肉瘤属于骨恶性肿瘤中发病率最高、恶性程度较高的肿瘤，成为儿童、青少年肿瘤相关致死病因的第二位，严重影响我国年轻人健康与生命[1]。文献报道显示[2]：肺部是骨肉瘤最为常见的转移器官(占90.0%)，且患者5年生存率仅有20.0%。细胞的增殖与凋亡属于是一种动态平衡，该平衡的打破是肿瘤产生的重要原因，也是肿瘤发生的重要病因。因此，临床上如何采取有效的措施抑制肿瘤的增殖，促进肿瘤的凋亡成为骨肉瘤治疗的热点[3]。肿瘤干细胞(Tumor stem cell)是指肿瘤内存在的一小部分细胞亚群，在肿瘤的生长、转移、侵袭及肿瘤血管化等方面起核心作用，能自我更新、分化和增殖。而传统手术、放疗、化疗之所以无法实现肿瘤的治愈，多是由于上述方法仅杀死了非肿瘤干细胞，缩小肿瘤体积，而忽略了肿瘤的“种子”-肿瘤干细胞[4]。研究表明[5]：线粒体融合基因2在骨肉瘤中能抑制干细胞增殖，有助于降低肿瘤转移率，但是不同学者试验结果存在争议。因此，本课题以MG63骨肉瘤细胞系、8周龄NOD/SCID小鼠作为研究对象，探讨线粒体融合基因2抑制骨肉瘤增殖及对其转移机制的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取6组8周龄NOD/SCID小鼠各20只作为研究对象，建立骨肉瘤成瘤和肺转移动物模型，根据Mfn2转染的骨肉瘤细胞随机分为转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63组、转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干细胞组、转染空质粒pEGFP-瘤MG63组、转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤干细胞组和空白对照1组和空白对照2组。120只小鼠体质量20～25 g，平均(21.45±4.75)g，所选动物均由医学动物实验中心提供，许可证号：scxk2008-0020。课题中对小鼠饲养、处理符合《关于善待实验动物的指导下意见》相关规则，饲养时控制实验室恒温(20±2)℃，恒湿50%～60%，实验均通过医院动物委员会批准同意。

1.2主要仪器和试剂：本课题所需仪器和试剂主要由人骨肉瘤MG63细胞株、real time PCR仪、Ministar低温超速离心机、Thermo全波长酶标仪、高速冷冻离心机、96孔细胞培养板、MTT、Mfn2多克隆抗体、手术器械一套等。

1.3方法：①骨肉瘤MG63及其干细胞Mfn2表达：将MG63骨肉瘤细胞系体外培养，通过球体培养实验(Sphere Culture Assay)分离出骨肉瘤干细胞。分离出骨肉瘤干细胞每14天传代1次，第三代骨肉瘤干细胞用于实验，运用RT-PCR技术检测Mfn2基因在骨肉瘤干细胞中的表达情况。引物序列：Mfn2上游引物5′-AGGGACTTGCCTCTCTTCTC-3′，下游引物5′-TCCACCATCCATCCTTCTAC-3′，产物片段143 bp；GADPH 上游引物5′-GACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，下游引物5′-CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′，产物片段187 bp。引物合成后完成组织总RNA的提取并合成cDNA的合成，最后进行PCR扩增，扩增完毕后采用光度计在260 nm/280 nm下测得，根据A260/A280比值完成纯度的测定(1.8～2.0)，测定完毕后利用浓度为2%琼脂糖进行电泳。②增殖实验：分别取Mfn2转染前、转染后的骨肉瘤干细胞，对两种细胞进行培养，分别在第1天、第3天、第5天、及第7天倒置显微镜下观察细胞增殖情况。③Mfn2对转移机制的影响：选取6组8周龄NOD/SCID小鼠各20只，20～25 g，雌雄各半。将实验细胞分为6组：转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63组、转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干细胞组、转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63组、转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤干细胞和空白对照2组实验细胞培养，选用第三代细胞。用无酶细胞分离溶液 (Sigma Biochemicals)悬浮形成单细胞悬浮溶液，细胞离心后PBS漂洗、重悬，再次离心。用PBS稀释成106cell/ml备用。腹腔注射麻醉小鼠后消毒双侧后肢，于右后肢胫骨结节处穿刺至骨髓腔缓慢注射上述细胞悬浮液0.2 ml。穿刺处给予骨蜡封闭，充分止血，术后给予复方新诺明100 mg/kg预防感染，处理后每3天处死2只小鼠，研究骨肉瘤的肺转移情况。

2 结果

2.1骨肉瘤MG63及其干细胞Mfn2表达：骨肉瘤MG63细胞中Mfn2表达水平高于干细胞(P<0.05)。见表1。RT-PCR技术检测结果表明：Mfn2在骨肉瘤MG63细胞中较干细胞中呈高表达，骨肉瘤干细胞表达Mfn2低于普通MG63细胞。

细胞类型Mfn2表达骨肉瘤MG63细胞0.64±0.16干细胞0.34±0.12t值16.993P值<0.05

2.2转染前、转染后骨肉瘤干细胞细胞增殖情况比较：转染前、转染后第1天、第3天细胞数量差异无统计学意义(P>0.05)。转染后第5天、第7天细胞数量，均少于转染前(P<0.05)。见表2。

2.3Mfn2在不同细胞转染后骨肉瘤肺部转移率比较：转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63组和转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干细胞组的小鼠骨肉瘤肺部转移均较转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63组、转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤干细胞组和空白组低，差异有统计学意义(P<0.05)。而转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干细胞组的小鼠骨肉瘤肺部转移较转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63组低，差异有统计学意义(P<0.05)。转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63组和空白对照骨肉瘤MG63组均较转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤干细胞组和空白对照骨肉瘤干细胞组骨肉瘤肺转移率低，差异有统计学意义(P<0.05)。其余差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

时间点第1天第3天第5天第7天转染前1.24±0.323.21±0.438.94±2.1613.26±3.09转染后1.21±0.283.03±0.385.61±2.018.56±2.69t值1.2050.58315.38218.438P值>0.05>0.05<0.05<0.05

组别第28天第35天第42天转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63组38.53±5.1240.44±5.1044.51±5.68转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干细胞组34.55±5.9335.51±6.0739.39±6.31转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63组51.09±5.9464.42±6.1270.94±6.28转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤干细胞组67.04±5.1673.01±5.1289.04±5.69空白对照骨肉瘤MG63组52.53±6.7163.32±7.9570.42±9.32空白对照骨肉瘤干细胞组66.09±6.7574.04±7.9788.44±9.34

3 讨论

骨肉瘤是临床上常见的原发性恶性肿瘤，多发生于儿童与青少年人群，严重影响我国青少年健康。目前，临床上对于骨肉瘤以手术治疗、放化疗为主，这些方法虽然能延缓病情发展，但是5年生存率较低，患者治疗后复发率、转移率较高，难以达到预期的治疗效果[6]。因此，临床上如何采取有效的措施对延长患者寿命、降低临床死亡率具有重要的意义。近年来，线粒体融合基因2(Mfn2)在骨肉瘤中得到应用，且效果理想。本研究中，RT-PCR技术检测结果表明：Mfn2在骨肉瘤MG63细胞中较干细胞中呈高表达，骨肉瘤干细胞表达Mfn2低于普通MG63细胞。由此看出Mfn2在干细胞中呈高表达，能抑制肿瘤细胞的增殖、分化。线粒体融合蛋白2基因是由我国学者发现，采用mRNA差异显示技术测得，限于当时水平并未进行深入研究。本研究骨肉瘤干细胞中，转染Mfn2前、转染后第1天、第3天细胞数量比较差异无统计学意义(P>0.05)，转染后第5天、第7天细胞数量均少于转染前(P<0.05)。由此看出Mfn2能抑制干细胞的增殖。文献报道显示[7]：Mfn2基因通常位于染色体36.22位置，发病后常呈缺失、易位等，有望成为治疗肿瘤的新靶点。本研究中，转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63组和转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干细胞组的小鼠骨肉瘤肺部转移均较转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63组、转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤干细胞组和空白组低，差异具有统计学意义(P<0.05)。而转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤干细胞组的小鼠骨肉瘤肺部转移较转染pEGFP-Mfn2骨肉瘤MG63组低，差异具有统计学意义(P<0.05)。转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤MG63组和空白对照骨肉瘤MG63组均较转染空质粒pEGFP-N1骨肉瘤干细胞组和空白对照骨肉瘤干细胞组骨肉瘤肺转移率低，差异具有统计学意义(P<0.05)，其余差异无统计学意义(P>0.05)。由此看出Mfn2能抑制骨肉瘤细胞的增殖、分化，能抑制肿瘤的转移，能为骨肉瘤临床治疗提供新的靶点，均需要进一步研究和探讨[8]。由此可见，基因靶向治疗骨肉瘤是目前治疗骨肉瘤的一个突破点[9-10]。

综上所述，Mfn2属于是一种抑癌基因，能抑制骨肉瘤及其干细胞增殖能力，并且能抑制肿瘤的转移，能为临床骨肉瘤的治疗提供新的靶点。

4 参考文献

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