佛波酯诱导小鼠慢性炎症模型考察肤光方抗炎作用的研究*

★ 杨富金 高燕妮 李敏 肖玉娟 江雪 刘毅

(重庆市中医院皮肤科 重庆 400011)

肤光方系我科的协定处方，主要由苦参、蛇床子、蒲公英、大叶桉、野菊花、地肤子等组成，治疗皮肤疾病常用的中药药浴处方。本处方具有清热燥湿、泻火解毒、祛风止痒功效，用于风湿热毒引起的各型湿疹，能显著改善患者的丘疹样皮肤及其增厚和鳞屑，减轻瘙痒，减少因瘙痒抓挠所致皮损[1-3]。

炎症贯穿于湿疹的整个发病过程，因此研究药物的抗炎作用具有重要意义。目前湿疹的动物模型多为炎症模型。炎症模型主要有小鼠耳肿胀模型、组肿胀模型和肉芽肿模型等评价药物的抗炎作用。其中小鼠耳肿胀模型因其操作简单，且小鼠价格便宜等优点，在评价抗炎活性时应用更为广泛。小鼠耳肿胀常用的致炎药物有二甲苯、花生四烯酸(AA)、佛波酯(TPA)、巴豆油、组胺和辣椒素等[4]。国内研究者常用二甲苯诱导的耳肿胀模型，笔者在前期研究中采用了二甲苯致炎，但是实验过程中发现该模型个体差异比较大，二甲苯致炎的炎症模型约30min后小鼠就能自愈，模型不稳定，这可能是国外不广泛使用的原因之一。目前国内采用佛波酯诱导的炎症模型较少，本文采用该种模型，为慢性炎症研究奠定一定的基础。

1 材料

1.1 药品与试剂 中药材均购自重庆市桐君阁股份有限公司，吲哚美辛购自重庆科瑞制药(集团)有限公司，佛波酯(TPA)购自Sigma-Aldrich，四甲基联苯胺购自damas-beta。

1.2 实验动物 昆明种小鼠，体重约为25g，雌性，60只，由第三军医大学大坪医院动物实验中心提供。

1.3 实验仪器 DMIL-FL-EL6000倒置荧光显微镜(LEICA DMIL LED德国)；BT-25S 精密天平(赛多利斯科学仪器有限公司 北京)；电子显数千分尺(东莞市景有模具五金有限公司)、DNM-9602G酶标分析仪(普朗新技术有限公司 北京)。

1.4 统计学处理 数据均使用spss15.0软件进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为具有显著性差异，P<0.001为有非常显著性差异。

2 实验方法

2.1 药液的制备 称取处方量的药材250g加水浸泡30min，水煎煮三次，每次使用10倍量的水，煮沸后保持微沸1h，合并三次的水提取液为A液，药渣再用75%乙醇提取三次，每次使用10倍量的醇，合并三次的醇提取液为B液，再合并A液和B液，浓缩至1 000mL定容，得浓度为0.25g/mL的肤光方高剂量组药液。同法制备中剂量组(0.05g/mL)和低剂量组(0.01g/mL)药液。

2.2 给药方案

2.2.1 动物分组 随机将动物分为6组，每组各10只，分别为肤光方高(0.25g/mL)、中(0.05g/mL)、低(0.01g/mL)剂量组、阳性药物组(吲哚美辛、0.05 g/mL)、模型组、正常空白对照组。

2.2.2 给药方案 通过TPA多次刺激诱导小鼠耳肿胀的慢性炎症模型，给药方案如下图1，每次用10μL的TPA(2.5μg /只)丙酮溶液涂抹小鼠右耳的内外侧，在第4次TPA刺激后开始连续每天给药，每天2次，第1次为直接涂抹TPA后，第2次为间隔6小时后，实验第10天早晨最后一次给药后处死动物进行下一步实验[5](注：TPA采用丙酮溶解，每次使用时需现配现用)。阳性药物吲哚美辛每次给药10μL，肤光方组每次给药10μL，模型组给予等体积的蒸馏水。

图1 TPA诱导小鼠耳肿胀慢性炎症模型的造模及给药方案

2.3 耳厚度及耳重量的测定 处死动物后将每组随机动物分成两组，其中一组立即用千分尺分别测量小鼠的左右耳厚度，并尽量选择在同一个位置，用6mm的打孔器打下小鼠的左右耳进行重量精密称定，记录数据后将标本冻存到-20℃的冰箱内，用于髓过氧化物酶的测定分析。另外一半浸泡至4%的福尔马林溶液用于病例切片分析。

2.3 病理切片 将浸泡到4%的福尔马林溶液中的耳组织样品，纵向平均切成两半，取其一半进行石蜡封片，切取3～4μm的样品进行苏木精-伊红染色，显微镜放大100倍，选择具有代表性的视野拍照，分析结果。

2.4 髓过氧化物酶(MPO)的测定[5]将6mm的组织用pH为5.4的PBS(0.5%HTAB配制)均浆，1.5mL的匀浆液4℃离心20min(12000g)，取上清液10μL加入96孔板中，每个样品平行操作3份，然后加入200μL的混合液(100μL的80mm的PBS；pH为5.4，85μL的0.22MPBS；pH为5.4，15μL的0.017%的H2O2)，反应的开始为加入20μL的18.4mm的四甲基联苯胺(8%二甲基甲酰胺水溶液)，37℃孵育3min，孵育后置于冰上，反应的终止为加入30μL的1.46mm的NaOAc(pH为3.0)，然后酶标分析仪620nm比色测定OD值。

3 实验结果

3.1 耳厚度及耳重量结果 肿胀主要是由于局部组织受到免疫或者其他理化因素刺激后，细胞的组织胺等介质被释放，通过H1和H2受体使皮肤、粘膜毛细血管扩张及毛细血管壁通透性增高，从而在患处产出红斑、水肿和风团[6]。在急性湿疹的临床表现中，患者感到剧烈瘙痒，局部进行搔抓后，还会导致局部毛细血管破裂及细菌感染，加重皮损局部肿胀。

本实验结果见表1、图2、图3，结果显示阳性药物吲哚美辛组用药后耳厚度差及耳重量差和模型组比较，具有显著性差异(P<0.01)；肤光方高剂量组用药后耳厚度差及耳重量差和模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；肤光方中剂量及低剂量组用药后和模型组比较，均无统计学差异。表明肤光方高剂量组有明显抑制TPA所致的小鼠耳廓肿胀作用。

表1 各组用药后耳厚度比较

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

图2 各种耳厚度差 图3 各种耳重量差

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

3.2 组织病理变化 结果如下图4，模型组(C)同空白对照组(D)比较,棘层明显增厚，有明显的炎症细胞浸润，提示造模成功；阳性药物组(A)和肤光方高剂量组(B)中增厚的棘层有所恢复，炎症细胞浸润有所改善。

A为阳性药物吲哚美辛组;B为肤光方高剂量 C为模型组;D为空白对照组

3.3 髓过氧化物酶(MPO)的测定 髓过氧化物酶(MPO)存在于嗜中性多形核白细胞(PMN)中，因其在该细胞中大量的存在(干重的5%)，而常常用该酶的水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞的功能和活性状态[7-8]，本文以OD值的大小代表MPO酶的活性，结果如图5，同模型组比较，阳性药物组和空白组有显著性差异(P<0.01)，说明TPA造模后的小鼠组织中，MPO酶明显增高，阳性药物吲哚美辛能够抑制炎症的发生；肤光方高剂量组和模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明肤光方高剂量组有抗炎的作用。

图5 各组MPO酶活性

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。

4 讨论

中医认为，湿疹病因病机较多，大抵由于禀赋不耐，饮食失节，或因食辛辣刺激荤腥动风之物，脾胃受损，失其健运，湿热内生，又兼外受风邪，内外两邪相搏，风湿热邪浸淫肌肤所致。西医按临床变现分类，将湿疹分为急性、亚急性及慢性三期，治疗以控制炎症、缓解瘙痒、延缓并减轻并发，提高患者生活质量为原则。

因此本文从药物的抗炎作用

入手，建立以TPA诱导的慢性炎症模型，证实了该模型具有较好的稳定性，TPA诱导的小鼠耳肿胀模型的主要机制为：TPA能诱导小鼠耳组织角质形成细胞产生T NF-α、 IL-1β和IL-6等炎症细胞因子，TP A刺激磷脂酶( PLA2)诱导A A释放，在环氧合酶(COX)和5-脂氧化酶(5-LOX)作用下，AA 代谢成为前列腺素E2 (PGE2)和白三烯 (LTB4 )，加重炎症，TPA还能促进组胺和5-羟色胺的释放[9-10]。同时以本科室的协定处方肤光方为模型药，证实了该方具有较强的抗炎作用。肤光方主要由苦参、蛇床子、蒲公英、大叶桉、野菊花、地肤子等药物组成，现代药理研究也表明，苦参、蛇床子、蒲公英、野菊花等对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀有显著的缓解作用，我们的实验结果与现代药理中的抗炎作用是一致的。

[1]钟声,刁庆春,刘毅,等.肤光洗液治疗豚鼠湿疹模型的药效学研究[C].全国中西医结合皮肤病学术会议论文汇编，2011:255.

[2]钱思雨,江雪,张钟,等.肤光方及其加减方的止痒药效观察[J].光明中医，2012，12(27)：2 471-2 472.

[3]卢芳,钱思雨,李敏,等，肤光方及其加减方体外抗金黄色葡萄球菌活性研究[J].中国中西医结合皮肤病学杂志，2014，13(2)：78-80.

[4]周娟,张梦军,郭嘉伟.小鼠耳肿胀模型及药理应用[J].国际检验医学杂志，2012，33(17)：2 102-2 104.

[5]Stanley PL,SteinerS,HavensM,et al.Mouse skin inflammation induced by multiple topical of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate[J].JEthnopharmacol,2009,124(3),649-652.

[6]徐拯,周将睿,孙学军.氢生理盐水对小鼠足肿胀的抗炎效应[J].现代生物医学进展.2010,10(23):4 421-4 423.

[7]Meri T, Town T, TanJ, et al. Modulation of astrocytic activation by arundic acid (ONO-2506) mitigates detrimental effects of the apolipoprotein E4 isoform after permanent focal ischemia in apolipoprotein E knock-in mice[J].Cereb Blood FlowMetab,2005,25(6):748-762.

[8]PP Bradley,DA Priebat,RD Christensen,et al.Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker[J].Invest Dermatol 1982,78(3):206-209.

[9]G Blazso,M Gabor.Effects of prostaglandin antagonist phloretin derivatives on mouse ear edema induced with different skin irritants[J].J Ethnopharmacol,1995,50(3):161-168.

[10]Stanley PL,S Steiner,M Havens,et al.Mouse skin inflammation induced by multiple topical application of 12-O-tetradecanoyphorbol-13-acetate[J].Skin Pharmacol,1991,4(4):262-271.