几种芳香植物精油的抑菌活性研究

王书平　吴涛　陆玉建

摘 要：该文采用水蒸气蒸馏法提取辛夷、艾蒿和黄花蒿精油，选取大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）2种细菌作为供试菌株，采用菌丝生长法测定3种芳香植物精油对2种细菌的抑菌活性。测试结果表明：辛夷、艾蒿、黄花蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌活性。

关键词：辛夷；艾蒿；黄花蒿；精油；抑菌活性

中图分类号 S482.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）02-0020-05

Abstract：Essential oils was extracted by steam distillation from three plants（Flos Magnoliae，Artemisia argyi，Aetemisia annua L.），selected E.coli （Escherichia coli） and S.aureus （Staphylococcus aureus） for the two bacteria strains tested，measured using the mycelium growth and development of three essential oil antibacterial activity against two bacteria.Test results showed that：Flos Magnoliae、Artemisia argyi and Aetemisia annua L.essential oils against E.coli and S.aureus have antibacterial activity.

Key words：Flos Magnoliae；Artemisia argyi；Aetemisia annua L.；Essential oils；Antimicrobial activity

植物精油是植物体内的一种次生代谢物质，由分子量相对较小的简单化合物构成，具有一定的芳香气味，并在常温下能挥发的油状液体物质。植物精油具有复杂的化学成分，将各种化学成分按其化学结构的差别可分为脂肪族、芳香族和萜类三大类化合物，以及它们的含氧衍生物，如醇、酮、酸、醚、酯、内酯等。另外，除了含氮和含硫的化合物，这些化合物的共同特点还有沸点低和易挥发[1-2]。

当前，对植物精油的抑菌活性研究主要在医用和农用2个方面。医用方面如：植物精油具有普遍的抗菌作用，如连翘精油对动物病原细菌（白葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）和酵母菌、黑曲霉等有很好的抑菌活性；丹参金露梅精油对多种植物病原真菌都有较好的抑菌活性[3-5]，薄荷精油的抑菌活性体现在能引发玉米穗腐病的串珠链孢菌[6]。农用方面如：其对农业害虫、植物病原菌表现出的生物活性引起了科研工作者的注意。至今，在农用杀菌活性方面获得广泛研究的植物有：菊科、芸香科、伞形科、唇形科、姜科、樟科、木兰科、桃金娘科、马兜铃科、马鞭草科、禾本科等10个科20余种植物[7]。另外，人们还开发研究了其余的精油类产品，如精油类农药和精油类食品防腐剂等[9-11]。大量研究表明，植物精油具有广谱的抗菌活性，多种植物精油联合使用能够提升抗菌活性，亦能拓宽抗菌谱，使其食品中用量降低、减少对食品风味的影响[12]

本实验主要研究3种芳香植物精油的抑菌活性，以常见的3种芳香植物为材料，利用水蒸气蒸馏法提取各种芳香植物精油，采用菌丝生长法测定芳香植物精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性，确定含高效抑菌活性物质的芳香植物精油，为野生植物资源综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 样品采集与制备 采样地点：滨州市滨城区郊区。样品种类：辛夷、艾蒿、黄花蒿。样品处理：在实验室中将样品进行清洗，去除土壤烘干捣碎备用。本实验使用菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，为本实验室所存。

1.1.2 实验仪器及试剂 仪器：双人单面净化工作台、低温生化培养箱、恒温振荡培养箱、紫外可见分光光度计、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、组织捣碎机、pH计、移液枪、接种针、涂布棒、打孔器、烧杯、锥形瓶、试剂瓶、广口瓶、玻璃棒、胶头滴管、量筒、试管、试管架、镊子、培养皿、酒精灯、钥匙、电炉子、牙签、脱脂棉、纱布。试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、丙酮、75%乙醇、95%乙醇、蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基 详见表1和表2。

1.2.2 水蒸气蒸馏法 称取实验材料干样50g（辛夷、艾蒿、黄花蒿）于圆底烧瓶A内，再加入500mL水，振摇混匀后，连接挥发油测定器B与回流冷凝管C。自冷凝管上端加水，使挥发油测定器的U形管内的水到达刻度线处，并出现有流入烧瓶内的现象时为止。放到电热套中缓慢加热至沸騰，然后调节电压至100V，保持微沸2h，直到测定器中精油量不再增加时停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓慢放出，再静置一段时间再开启活塞使精油收到培养瓶中，放入4℃冰箱中保存。装置如图1所示。

1.2.3 菌悬液的制备 大肠杆菌菌悬液的制备：取长有大肠杆菌的斜面试管，用接种针挑取大肠杆菌，在固体培养基平板上进行四区划线，然后用封口膜封好后放入37℃生化培养箱内培养24h。取出平板，用接种针挑取单菌落放入装有100mL液体培养基的锥形瓶中，放入37℃恒温振荡水浴锅内培养约9h，测定其OD值达0.8时即可使用。金黄色葡萄球菌菌悬液的制备：取长有金黄色葡萄球菌的平板，用接种针挑取金黄色葡萄球菌，在固体培养基平板上进行四区划线，然后用封口膜封好放入37℃生化培养箱内培养24h。取出平板，用接种针挑取单菌落放入装有100mL液体培养基的锥形瓶中，放入37℃恒温振荡水浴锅内培养约8h，测定其OD值达0.8时即可使用。

1.2.4 辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的抑菌效力测定 采用琼脂扩散法测定辛夷、艾蒿和黄花蒿精油的抑菌圈直径：用打孔器将干净的吸水性较强的优质滤纸制成直徑为6mm的圆纸片，干热灭菌后备用。在无菌条件下，向固体培养基平板内注入供试菌菌悬液各100μL到相应菌种的培养基平板上，用涂布棒涂抹均匀。将含有精油的滤纸片平展放入在营养皿中。精油在固体培养基平板上不断向纸片周围扩散，使滤纸片周围的测试菌生长受到抑制而形成透明的抑菌圈，滤纸片周围有抑菌圈者为阳性，无抑菌圈者则为阴性。根据抑菌圈的大小可判断样品抑菌作用的强弱，同时以加无菌水及丙酮的滤纸片作为空白对照测试，以排除所用试剂的干扰。在37℃生化培养箱内恒温培养24h后，测定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，重复试验3次。

1.2.5 辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低抑菌浓度（MIC）测定 采用试管液体培养基稀释法测定3种芳香植物精油的最低抑菌浓度（MlC，the minimum inhibitory concentration）。具体步骤如下：（1）摆好试管进行编号W1～W9，W1～W6为测试管，W7号试管为培养基对照管，W8号试管为加丙酮的对照管，W9号试管为加菌悬液的对照管。（2）由于精油与水是不相混溶的，所以试验中选用丙酮作为介质，其与精油的体积比为1∶1。取精油0.5mL和丙酮0.5mL混匀备用。（3）取精油与丙酮的混合液160μL加入W1号试管，再加入4.84mL液体培养基，混匀。（4）向W2～W7、W9号试管中分别加入2.5mL液体培养基。（5）取W1号试管的混合液体2.5mL加入2号试管混匀；取2号试管的混合液体2.5mL加入W3号试管混匀；照此顺序，用二倍稀释法依次稀释剩余试管，使其精油浓度梯度设置为0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%。（6）向W8号管加80μL丙酮、80μL无菌水和4.84mL液体培养基，混匀。（7）向W1～W6、W8～W9号试管分别加50μL菌悬液，震荡后放入37℃生化培养箱内培养24h后观察试管的浑浊度，重复实验3次。实验结论根据试管浑浊度判断，澄清的试管说明没有长菌，浑浊的试管说明有菌生长。

1.2.6 辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低杀菌浓度（MBC）测定 最低杀菌浓度（MBC Minimal bactericidal concentration）就是指精油能杀死微生物的最低浓度，最小杀菌浓度的测定可以和最低抑菌浓度的测定同步进行。将最低抑菌浓度测定实验结果中澄清和较澄清的试管进行涂平板，然后放入生化培养箱内在37℃下培养1d，以完全没有菌落生长的最低精油浓度为最低杀菌浓度。

2 结果与分析

2.1 辛夷精油对各种测试菌抑菌效力 采用琼脂扩散法[13]测定辛夷精油对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性，抑菌效果见图2。若辛夷精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，则滤纸片周围会有抑菌圈出现，而且辛夷精油对测试菌的抑菌作用越强抑菌圈的直径会越大。从抑菌圈判定标准[14]来看：抑菌作用效果以抑菌圈直径在小于10mm为不敏感，在10～15mm为敏感，在15～20mm为中度敏感，大于20mm为高度敏感。由图2中（B、C、E、F）可知，对照组中无菌水对照和丙酮对照中供试菌生长良好，没有抑菌圈。实验组中辛夷精油对供试菌有一定的抑菌效果，对大肠杆菌的抑菌直径为10～11mm，证明大肠杆菌对辛夷精油为敏感，如图2（A）所示。辛夷精油对金黄色葡萄球菌的抑菌直径为16～18mm，证明金黄色葡萄球菌对辛夷精油为中度敏感，如图2（D）所示。

2.2 辛夷精油的最低抑菌浓度（MIC） 采用试管液体培养基稀释法[15]，由于精油不溶于水，用丙酮作溶剂，将待测精油与液体培养基充分振荡混合均匀，保证待测精油在液体培养基中具有符合要求的均匀度。从表3中可看出：辛夷精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑菌效果，并且随着辛夷精油浓度不断增大抑菌效果越来越明显；而以丙酮和无菌水作对照的试管中供试菌生长良好。从表3中可粗略估计，辛夷精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.1%～0.2%，辛夷精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.05%～0.1%。此结论对精油抑菌的后续研究具有重要意义。

2.3 辛夷精油的最低杀菌浓度（MBC） 从表4中可看出：辛夷精油不仅对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，而且当辛夷精油达到一定值时，对两种菌则能产生杀菌效果。从表4中可粗略推知，辛夷精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.2%～0.4%，辛夷精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.1%～0.2%，但准确浓度需要进一步试验才能获得。

2.4 艾蒿精油对各种测试菌抑菌效力 采用琼脂扩散法[13]测定艾蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性。抑菌效果见图3。若艾蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，则滤纸片周围会有抑菌圈出现，而且艾蒿精油对测试菌的抑菌作用越强抑菌圈的直径会越大。从抑菌圈判定标准[15]来看：抑菌作用效果以抑菌圈直径在小于10mm为不敏感，在10～15mm为敏感，在15～20mm为中度敏感，大于20mm为高度敏感。由图3中（B、C、E、F）可知，对照组中无菌水对照和丙酮对照中供试菌生长良好，没有抑菌圈。实验组中艾蒿精油对供试菌有一定的抑菌效果，对大肠杆菌的抑菌直径为7～9mm，证明大肠杆菌对艾蒿精油为不敏感，如图3（A）所示。艾蒿精油对金黄色葡萄球菌的抑菌直径为10～11mm，证明金黄色葡萄球菌对艾蒿精油为敏感，如图3（D）所示。

2.5 艾蒿精油的最低抑菌浓度（MIC） 采用试管液体培养基稀释法[15]，由于精油不溶于水，用丙酮作溶剂，将待测精油与液体培养基充分振荡混合均匀，保证待测精油在液体培养基中具有符合要求的均匀度。从表5中可看出：艾蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑菌效果，并且随着艾蒿精油浓度不断增大抑菌效果越来越明显；而以丙酮和无菌水作对照的试管中供试菌生长良好。从表5中可粗略估计，艾蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.4%～0.8%，艾蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.1%～0.2%。此结论对精油抑菌的后续研究具有重要意义。

2.6 艾蒿精油的最低杀菌浓度（MBC） 从表6中可看出：艾蒿精油不仅对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，而且当艾蒿精油达到一定值时，对两种菌则能产生杀菌效果。从表中可粗略推知，艾蒿精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.8%～1.6%，艾蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.2%～0.4%，但准确浓度需要进一步试验才能获得。

2.7 黄花蒿精油对各种测试菌抑菌效力 采用琼脂扩散法[13]测定黄花蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性，抑菌效果见图4。若黄花蒿精油对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌有抑制作用，则滤纸片周围会出现抑菌圈，而且黄花蒿精油对测试菌的抑菌作用越强抑菌圈的直径会越大。从抑菌圈判定标准[14]来看：抑菌作用效果以抑菌圈直径在小于10mm为不敏感，在10～15mm为敏感，在15～20mm为中度敏感，大于20mm为高度敏感。由图4中（B、C、E、F）可知，对照组中无菌水对照和丙酮对照中供试菌生长良好，没有抑菌圈。实验组中黄花蒿精油对供试菌有一定的抑菌效果，对大肠杆菌的抑菌直径为10～12mm，证明大肠杆菌对黄花蒿精油为敏感，如图4（A）所示。黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的抑菌直径为6～8mm，证明金黄色葡萄球菌对黄花蒿精油为不敏感，如图4（D）所示。

2.8 黄花蒿精油的最低抑菌浓度（MIC） 采用试管液体培养基稀释法[15]，由于精油不溶于水，用丙酮作溶剂，将待测精油与液体培养基充分振荡混合均匀，保证待测精油在液体培养基中具有符合要求的均匀度。从表7中可看出：黄花蒿精油对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌都有明显的抑菌效果，并且随着黄花蒿精油浓度不断增大抑菌效果越明显；而以丙酮和无菌水作对照的试管中供试菌生长良好。从表中可粗略估计，黄花蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.20%～0.40%，黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.40%～0.80%。此结论对精油抑菌的后续研究具有重要意义。

2.9 黄花蒿精油的最低杀菌浓度（MBC） 从表8中可看出：黄花蒿精油不仅对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，而且当黄花蒿精油达到一定值时，会对两种菌产生杀菌效果。从表8中可粗略推知，黄花蒿精油对大肠杆菌的最低杀菌浓度为0.40%～0.80%，黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为0.80%～1.60%，但准确浓度需要进一步试验才能获得。

2.10 辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低抑菌浓度比较 从表9中可看出：辛夷、艾蒿、黄花蒿3种植物提炼的精油中，可以比较出：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对辛夷精油都为高度敏感；其中，大肠杆菌对艾蒿精油不敏感，对黄花蒿精油中度敏感，金黄色葡萄球菌对黄花蒿精油不敏感，对艾蒿精油中度敏感。

2.11 辛夷、艾蒿、黄花蒿精油的最低杀菌浓度比较 从表10中可看出：辛夷、艾蒿、黄花蒿3种植物提炼的精油中，可以比较出：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对辛夷精油都为高度敏感；其中，大肠杆菌对艾蒿精油不敏感，对黄花蒿精油中度敏感，金黄色葡萄球菌对黄花蒿精油不敏感，对艾蒿精油中度敏感。

3 讨论与结论

3.1 讨论 在芳香植物精油的提取方面，从实验中可以知道，芳香植物精油的提取并不简单，芳香植物精油通常的提取方法有水蒸气蒸馏法、浸取法和冷压法等，本实验过程中主要用水蒸气蒸馏法对3种芳香植物精油进行提取，虽然较其他的方法较优秀，但因为3种植物中含精油量并不是很高，提取效果并非很理想，在后续实验中希望能将3种芳香植物精油的提取方法进行改善，尽可能提高精油的提取率。本实验重在测定精油对细菌的抑菌作用，所以在整个过程中避免杂菌污染是非常重要的，虽然在超净工作台中完成菌悬液的制作，接种抑菌的实验步骤，但是由于实验操作不当和没有注意避免污染等原因，在实验过程中造成多次污染，使得实验材料浪费和实验结果不准确等后果，希望无菌操作过程能进一步得到熟练。

就目前从国内外对辛夷精油的研究和开发来看，仅限于辛夷精油提取和鼻炎治疗，但辛夷精油的提取率低，精油也不能全面地利用，辛夷还有其他的药理作用也未开发出来，值得进一步研究开发。艾蒿是一种多功能的植物，具有很多作用，而且分布广，价格低廉，但现在人们利用的很有限，所以在以后的研究中，艾蒿的各种作用值得深入研究。黄花蒿在我国分布比较广，花期较长，花期花序占整个植株比例大，精油含量较高，而且该种精油香气好、毒性低、对皮肤无刺激并有一定的杀、抑菌作用，因此，黄花蒿精油作为化妆品工业的天然香料來源是很有前途的，值得进一步研究。

3.2 结论 通过本实验可初步得出：辛夷精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.10%～0.20%，最低杀菌浓度为0.20%～0.40%；而辛夷精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.05%～0.10%，最低杀菌浓度为0.10%～0.20%；艾蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.40%～0.80%，最低杀菌浓度为0.80%～1.60%；而艾蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.1%～0.2%，最低杀菌浓度为0.20%～0.40%；黄花蒿精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.20%～0.40%，最低杀菌浓度为0.40%～0.80%；而黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.40%～0.80%，最低杀菌浓度为0.80%～1.60%。综上所述，辛夷、艾蒿、黄花蒿精油在抑菌方面有很大的作用，值得进一步开发研究。

参考文献

[1]庞建光，张明霞，韩俊杰.植物精油的研究及应用[J].邯郸农业高等专科学校学报，2003，20（1）：2.

[2]张金生，李丽华.植物精油提取技术的研究进展[J].辽宁石油化工大学学报，2006，26（4）：137-138.

[3]宁蕾.5种植物精油的生物活性及其应用研究[D].桂林：广西师范大学，2011.

[4]江燕，章银柯，应求是.我国芳香植物资源开发应用现状及其利用对策[J].中国林副特产，2007（5）：64-67.

[5]Pitarokili D，TzakouZ O，Loukis A，et al..Volatile metabolites from Salvia fruit cosa as antifungal agents in soil borne pathogens[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（11）：3294-3301.

[6]Mueller R F，Berger B，Yegen O.Chemical composition and fungi toxic properties to phyto-pathogenic fungi of essential oils of selected aromatic plants growing wild in Turkey[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43（8）：2262-2266.

[7]刘志强.芳香疗法在园林中的应用研究[J].林业调查规划，2005，30（6）：91-93.

[8]袁敏之.几种植物精油的提取及其在化妆品中的应用[J].日用化学品科学，1996，90（5）：39-41.

[9]吴佩文.植物精油类农药[J].世界农药，1999，21（6）：23-27.

[10]杜芸.天然食品防腐剂的研究进展[J].食品研究與开发，2006，27（3）：162-165.

[11]肖素荣，李京东.天然食品防腐剂及其发展前景[J].中国食物与营养，2007（6）：30-33.

[12]LU Fei，DING Yi-cheng，YE Xing-qian，et al.Antibacterial effect of cinnamon oil combined with thyme or clove oil [J].Agricultural Sciences in China，2011，10（9）：1482-1487

[13]周帮靖.常用中药的抑菌作用及其测定方法[M].重庆：科技文献出版社重庆分社，1987：289-231.

[14]蔡一鸣，任荣清，文正常.中药方剂的抑菌试验[J].贵州畜牧兽医，1995，19（4）：4-5.

[15]邓业成，宁蕾.4种植物精油的抑菌活性及应用[J].广西师范大学学报，2012，30（3）：2-3.

（责编：张宏民）