桉树叶片蛋白质和硝态氮的动态观察

朱宇林 周兴文 卓艳霞 苏建睦 谭萍

摘 要 研究桉树叶片贮藏蛋白质和硝态氮的动态变化规律，为提高桉树氮素利用效率及实现人工林的可持续发展提供科学依据。采用考马斯亮蓝法和水杨酸法测定了桉树叶片的蛋白质含量和硝态氮含量，并探讨叶片中硝态氮和蛋白质之间的相关性。结果表明：（1）桉树叶片总蛋白质含量随季节发生规律性的变化，早春生长时期叶片蛋白质含量急剧下降，至3月份下降到最低，之后在1.728～2.242 μg/mg FW呈波浪式变化；（2）桉树叶片硝态氮含量也具有季节性的变化规律，冬季和春季时期硝态氮含量下降，从4月份开始上升，至6月份后又开始下降，秋季时期上升，总体上呈一个“W”字型的变化趋势；（3）桉树叶片硝态氮和蛋白态氮代谢的相关性并不显著。综合分析得出，桉树的叶片中总蛋白质含量的动态变化与树木营养生长的变化规律相一致，可作为桉树合理施肥的一个重要参考指标。桉树春季生长所需的氮化物可能来自冬季休眠期积累的贮藏蛋白质和叶片中的硝态氮。

关键词 桉树 ；贮藏蛋白质 ；硝态氮 ；氮代谢

中图分类号 S792.39 ；Q949.762.2 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.019

Abstract The dynamic changes of the storage proteins and nitrate nitrogen of Eucalyptus leaves were observed to provide reference for improved uptake of nitrogen by Eucalyptus and sustainable development of Eucalyptus plantations. The protein content and nitrate nitrogen content in the leaves of Eucalyptus were determined according to the Lowry-Folin method and salicylic acid method， and the relationship between the leaf nitrate nitrogen and the leaf protein content were analyzed. The results showed that the total protein content of Eucalyptus leaves changed regularly with the seasons， declining sharply at the growth stage in early spring， down to the lowest in March， and changing between 1.728 and 2.242 μg/mg FW in a wave way. The nitrate content of Eucalyptus leaves also showed a regular change with the seasons， declining in winter and spring， up in April， down after June， up in autumn， generally showing a W trend. The metabolism correlation between the nitrate nitrogen and protein nitrogen of Eucalyptus leaves was not significant. Comprehensive analysis showed that the dynamic changes of the total protein content in Eucalyptus leaves were consistent with those of vegetative growth of trees， which could be used as an important indicator of fertilizer dressing for Eucalyptus. The nitrogen compounds needed for growth of Eucalyptus in Spring may be mainly due to the accumulation of storage proteins and the nitrate nitrogen in the leaves in a dormancy period of winter.

Keywords Eucalyptus ； storage protein ； nitrate nitrogen ； nitrogen metabolism

桉樹是常绿阔叶树种，树干通直，具有适应性强、生长迅速、轮伐期短等特点。因桉树用途广泛、经济效益高而在中国南方地区被大面积密集种植，成为农民增收的一条重要途径，对中国的经济发展起到巨大的促进作用[1-2]。然而广西桉树种植区的土壤养分含量相对比较贫瘠[3]，难以满足桉树快速生长对营养的需要。树木需求量最大的矿质营养元素是氮素，树木根系吸收的氮化物在树体内的转移和重复利用对提高营养氮素的利用率具有决定性影响[4-5]。营养贮藏蛋白质（VSP）是氮素在树木营养器官中储存的主要形式[6-7]。研究桉树叶片蛋白质和硝态氮的年动态变化规律，对桉树营养贮藏蛋白质的研究和利用有重要意义。目前关于桉树的栽培和管理技术方面的研究报道不少，主要针对不同土壤类型、不同桉树种类和不同肥料种类的施肥效应的研究[8-9]。陈少雄等[10]对尾叶桉的施肥结果表明，施用单一肥或2种元素的复合肥比N、P、K复合肥效果差，不施肥结果和只施N肥的效果相近。周宽[11]发现，不同的施肥处理方式，对桉树树高的影响并不是很明显。这表明，氮素营养在桉树生长过程中起到非常重要的作用。硝态氮可作为信号物质来调节植物的生长和发育，树木营养贮藏蛋白质的积累和降解与硝态氮的吸收转运、同化及再利用密切相关。目前关于桉树叶片氮素积累与降解的调节机制和营养贮藏蛋白质的变化规律，以及蛋白质与硝态氮代谢相关性的研究少有报道。因此，研究桉树氮素积累与降解的调节机制和贮藏蛋白质的变化规律，探讨蛋白质与硝态氮代谢相关性，可为指导人工林合理施肥和培育高氮利用率优良品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验采用的材料来源于玉林师范学院东校区的广林九号桉。选取无病虫害、生长健壮的植株，采集2016年1～12月的桉树一年生枝叶，每月中旬采集一次；用袋子封装好贴上标签保存在超低温冰箱中，待用于各项指标的测定分析。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质的测定

采用考马斯亮蓝法[12]。称取叶片0.5 g，加入Tris-HCl緩冲液（pH 7.8）5 mL和少许石英砂，冰浴研磨成浆，将匀浆倒入10 mL离心管，在13 000×g、4℃条件下离心40 min，弃沉淀取上清液，按Lowry-Folin 方法进行蛋白质测定，将上述提取液适当稀释，取2支试管，分别加入样液1.00 mL；再分别精确加入1.00 mL 的ABC混合试剂，充分摇匀，于室温静置15 min； 然后在每只试管中分别准确加入3.00 mL Folin-酚试剂稀释液，立刻震荡，充分摇匀；静置30 min后，于540 nm波长下分别测定试管中溶液的吸光度。

1.2.2 硝态氮的测定

采用水杨酸硝化法[12]。取一定量的桉树叶片剪碎混匀后，精确称取2 g，放入刻度试管中，量取10 mL无离子水加入试管，用塞子封口，置于沸水浴中提取30 min后用冷水冷却；将提取液过滤到25 mL容量瓶中，并用无离子水反复冲洗残渣，加入冲洗液定容至刻度；测定样品中硝态氮含量时，用移液管吸取0.1 mL样液分别加入3支试管中，然后分别加入0.4 mL 5%的水杨酸-硫酸溶液，混匀后置室温下20 min；再缓慢加入8% NaOH溶液 9.5 mL，冷却到室温，于410 nm处测其吸光度。

1.2.3 数据统计分析

采用Word、Excel和SAS 8.01统计分析软件对实验数据进行处理，差异的显著性检验采用Duncan氏法处理。

2 结果与分析

2.1 总蛋白质含量的年动态变化规律

由图1可以看出，速生桉树叶片总蛋白质含量随季节发生规律性的变化，一年中总蛋白质含量先下降后上升，至7月份后又开始下降，总体呈现先下降后上升的变化趋势。1～3月份蛋白质含量下降最快，到3月份下降至一年中最低，下降了57.3%，这个时期桉树大量抽生新梢，快速生长需要分解大量的贮藏蛋白质。3～7月份蛋白质含量逐渐上升，积累速度较慢，到夏季7月份时桉树叶片蛋白质含量开始逐渐下降，9月份有所上升但随后又下降，至12月份下降至最低，此时与3月份相比较略高一点。2016年1月份的叶片蛋白质积累量达到一年中最大值，可能是因为玉林冬季12月和次年1月平均气温最低，这个时期桉树基本停止生长，贮藏蛋白质在这个时期快速积累，至第二年1月份达到最大值。

对2016年12个月的桉树叶片总蛋白质含量进行多重比较和方差分析，结果（图1）表明，1月份和其他月份相比，蛋白质含量差异达到极显著水平。综合比较4、5、6、8、9、10、11、12月份可知，蛋白质含量差异并不显著，但是与7月份相比，差异达显著水平（p<0.05）。3月份到12月份，桉树叶片总蛋白质含量变化并不大，在1.728～2.242 μg/mg FW波动。

综合分析认为，早春气温比较低，根系的吸收能力较弱，从土壤中吸收的营养物质不能满足树木生长需要，此阶段桉树叶片总蛋白质含量和硝态氮含量急骤下降，表明早春桉树生长所需的氮素营养物质主要由树体自身的贮藏氮化物提供。3月份到12月份，桉树叶片总蛋白质含量变化非常小，总体呈波浪型变动，在8、9、10月份蛋白质含量呈上升-下降的变化趋势，10月以后都呈下降趋势，这种变化趋势，与王改萍等[13]研究得出的银杏叶片中蛋白质含量变化规律相似，不同的是至12月中旬银杏叶片蛋白质含量几乎降为零，而桉树叶片蛋白质含量至初冬时降到与5月份几乎持平，出现这样的结果，可能是落叶树种与常绿树种不同的原因。叶片在脱落前是否已经将蛋白质降解转移到树体的其他组织中有待深入研究。

2.2 硝态氮含量的动态变化特征

由图2可以看出，桉树叶片硝态氮含量具有季节性的变化规律，冬季和春季时期硝态氮含量下降，至4月份开始上升，到6月份后又开始下降，秋季时期上升，总体上呈一个“W”字型的变化趋势。12月至4月份桉树叶片硝态氮含量逐月下降，下降到一年中最低，只有0.438 mg/g FW，与12月份相比，下降了66.9%。进入夏季的时候硝态氮含量先上升，随后下降，上升量和下降量相差3.9%，整体变化量很小。秋季时期叶片开始逐渐积累硝态氮，其中9月到10月份积累速度最快，到12月份达到一年中最大值，为1.324 mg/g FW，与7月份相比，增长了65.6%。2016年桉树叶片硝态氮含量在0.438～1.324 mg/g FW波动。

对桉树叶片12个月份的硝态氮含量进行方差分析及多重比较，结果（图2）表明，2016年中桉树叶片硝态氮含量差异达到显著水平（F=151.91，p<0.000 1）。综合比较5月份与7月份，硝态氮含量不存在显著差异，10月份与11月份也没有达到显著差异水平，但与其他月份相比都达到显著差异水平。12月份与5、7月份比较，硝态氮含量差异达到极显著水平。

2.3 硝态氮和蛋白态氮代谢的相关性分析

桉树叶片中硝态氮和蛋白质代谢的相关性如图3所示。1～6月份变化趋势基本相同，都是先下降后上升，不同的是蛋白质含量在3月份后开始上升，而硝态氮在4月份开始上升，这个时期桉树抽生新叶，蛋白质和硝态氮都被转运降解，当硝态氮供应充足时，多余的硝态氮被还原，用于合成贮藏蛋白质或其他氮化物积累在某些特定的组织中，所以蛋白质先于硝态氮增加。总蛋白质含量上升到7月份后开始下降，硝态氮含量上升到6月份开始下降。夏季和秋季期间蛋白质含量有微小波动，整体呈缓慢下降趋势，而硝态氮含量从7月份开始快速积累，到12月份积累到最大量。从叶片总蛋白质和硝态氮含量的整体变化趋势来看，速生桉树叶片硝态氮与蛋白质氮代谢的相关性并不显著。

3 讨论与结论

桉树为常绿树种，生长速度快，除了冬季短暂的休眠期外，桉树的生物量都在增加。初春时期桉树枝条和叶片蛋白质含量都处在一个比较高的水平，这是冬季休眠时期积累的营养贮藏蛋白质储存在枝叶中，为春季桉树的生长提供营养需要[14]。初春时期，桉树开始长出新叶、新梢，需要大量营养物质，特别是氮素，但是早春时期，气温比较低，光照强度不大，叶片的光合作用较弱，有机物合成量少，而根系的吸收能力未恢复，因此早春桉树生长所需的氮素营养物质只能由樹体自身的贮藏氮化物提供。随着新叶的生长，树体光合作用增强 ，根系从土壤中吸收矿质养分运输至叶片，开始积累营养物质，3月中旬后蛋白质含量和硝态氮含量开始上升。叶片蛋白质含量积累到7月份后有微小波动，先下降后上升再下降，至12月降到最低。赵成帅[15]在枣树营养贮藏蛋白质的细胞学研究中，结果表明枝条中营养贮藏蛋白质的变化规律与其新梢的生长呈现相反的变化趋势，新梢生长阶段蛋白质降解，落叶期积累，落叶期间叶片中的营养贮藏蛋白质降解，营养物质转移到枝条内贮藏，减少养分的流失。本实验与赵成帅研究结果较为一致，只是枣树是落叶树种，叶片中的蛋白质含量变化比较大，而桉树是常绿树种，变化幅度小一些，这表明常绿树木较落叶树木中蛋白质含量的季节性变化不明显， 但仍然表现出类似的蛋白质含量季节性波动。

叶肉细胞液泡是一个可以高浓度贮存硝态氮的场所，叶肉细胞中存在还原硝酸盐的酶系，硝态氮可以在叶肉细胞中被还原成铵态氮供植物所利用。1～4月份，桉树叶片硝态氮含量下降趋势明显。有研究表明，温度的改变会影响植物对硝态氮的吸收，与3℃相比，30℃时植物对硝态氮的吸收显著增强[16]。初春土壤温度较低，抑制了根系吸收营养的能力，植物从土壤中吸收的硝态氮在根组织中大部分被还原，以供枝干生长；随着光照强度增加，叶肉细胞中的硝酸还原酶活性增强，将硝态氮还原为铵态氮，所以叶片中硝态氮含量不断减少。4月份时气温变得较高，根系吸收营养物质的能力得到恢复，根系吸收硝态氮的量增多，向枝叶运输硝态氮的量增多，所以4月份到6月份叶片中的硝态氮含量逐渐增加。6月份和7月份桉树生长最为快速，树体的各个生理机能较强，合成有机物增多，需要的氮化物增多，硝态氮转化为最终产物氨基酸，用于合成蛋白质，所以叶片的硝态氮含量减少而蛋白质含量增多。值得注意的是叶片总蛋白质含量在9月份后开始逐渐下降，也就是在秋季和初冬时期，桉树的贮藏氮化物在缓慢降解，而同时期的硝态氮含量却在不断积累。有研究认为，氮素在新梢停止活跃生长时开始回撤，叶片中的蛋白质降解向树体回撤的氮，主要贮藏在枝条和根组织中[17]。所以在秋季叶片开始衰老时，叶片中的蛋白质含量减少，而枝条的蛋白质逐渐增加，此时根系还能从土壤中吸收硝态氮，但叶片的蛋白质已经不再积累而是降解，转运到叶片的硝态氮没有被转化而在叶片中大量积累。

本研究对桉树叶片蛋白质和硝态氮的动态规律进行探讨，发现叶片蛋白质含量的年动态变化规律与树木自身的生长习性相一致，这说明叶片的总蛋白质含量变化是诊断桉树内部氮素营养状况的一个重要指标，桉树叶内的蛋白质水平在一定程度上可作为合理施肥的参考依据。总的来说，本研究仅探讨了叶片蛋白质和硝态氮的动态变化，在一定程度上丰富了桉树氮素营养代谢的基础理论研究，但尚未能直接科学地反映桉树贮藏蛋白质的变化规律，若要对桉树人工林的氮素养分管理提出科学的指导，仍需从不同的方向做大量深入研究。

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