土壤微生物多样性研究方法及其在土传病害防治中的应用展望

周登博 井涛 陈宇丰 冯仁军 起登凤 张妙宜 谢江辉

摘 要 土壤质量是影响植物生长的关键因子，土壤微生物是评价土壤质量的重要指标，土壤微生物种群多样性及优势菌属的变化，可以在一定程度上反映出土壤质量随环境的变化过程。因此，系统研究土壤微生物的多样性，不仅是防控植物土传病害的关键环节，还是改良土壤质量的重要内容。本文综述了土壤微生物多样性的主要研究方法，包括传统生物化学、现代分子生物学技术以及高通量测序方法等，阐述了各种方法的应用原理、优缺点。从土壤微生态平衡的角度，对土壤微生物多样性研究在土传病害防控中的应用进行展望，提出新的研究内容与思路，以便更好地应用于土传病害微生态调控。

关键词 土壤 ；微生物多样性 ；生物化学技术 ；分子生物学技术

中图分类号 S154 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.016

Abstract Soil quality is a key factor affecting the growth of a plant， and soil microbes are a key index for evaluation of the soil quality. The change of microbial population diversity and dominant species can reflect to some extent the change of soil quality with the environment. So， systematic research on the diversity of soil microbes is a key step of the control of soil borne diseases and an important subject to improve the soil quality. The main research methods for soil microbial diversity were reviewed， including traditional biochemistry， modern molecular biology techniques and high throughput sequencing method， and the principles， advantages and disadvantages of each method were described. From the aspect of the ecological balance of soil microbes， a prospect was made for the application of soil microbial diversity in the control of soil-borne diseases， and some new ideas for research were put forward in order to conduct micro ecological control of soil-borne diseases.

Keywords soils ； microbial diversity ； biochemical technology ； molecular biology

土壤中生活着数量庞大的微生物种群，这些种群包括细菌、真菌、放线菌等，直接参与土壤的生物生化过程，调节土壤生态系统中碳、氮、磷、钾、钙等重要元素的物质循环[1]，同时还承担有机养分的分解转化、土壤环境污染物净化等多种生态功能[2]，在生态系统中起着举足轻重的作用。由于土壤微生物對环境变化非常敏感，已成为评价土壤养分及生态质量变化最具潜力的生物指标之一[3]。近年来，通过研究香蕉枯萎病的发生、扩展、蔓延、防控，发现对于土传真菌性病害，可通过微生物制剂及菌肥、有机肥、轮作等措施，改良土壤微生物群体结构，有效抑制土传病害病原菌的繁殖，达到控制病害的目的。然而，有关土壤微生物群落多样性的研究往往费时费力，且不能全面、准确地反映土壤微生物状况。一方面是由于用于种类测定的方法和技术体系尚不成熟，如常规的分离培养反映的只是1%可以被分离培养的微生物；另一方面是由于土壤微生物对环境变化的敏感性，微生物群落会随着土壤环境的时空变化而变化[4]，给研究带来诸多困扰。本文简要介绍了目前国内外土壤微生物多样性的研究方法，对其原理、优缺点进行阐述，并将改良土壤微生物的理念和技术带入土传真菌病害防控工作中，以期更好地应用于实践生产。

1 土壤微生物多样性概述

土壤微生物种类多，组成复杂[5]，与土壤物质循环及能量转移转化密切相关[6]，在生物地球化学循环（biogeochemical cycles，BGC）过程中起着至关重要的作用[7-8]，并对土壤中有机、无机养分的转换产生重要的影响[9]。土壤微生物的多样性主要包括遗传多样性、物种多样性、结构多样性和功能多样性等。其中遗传多样性是指在基因水平上，土壤微生物不同种群遗传信息和遗传物质的差异；物种多样性是指土壤微生态系统中物种的丰富度和均一度，其中包括可培养和不可培养2类，是反映多样性最直观的形式；结构多样性是指土壤微生物在细胞组分变化上的多样性，可直接导致土壤中微生物代谢水平的差异；功能多样性是指土壤中特定的微生物种群所执行的功能差异，如对植物生长促生作用、营养的分解、转化与传递等[10-11]。这四种多样性从不同角度分析了土壤微生物的微生态情况，可根据研究目的，选择1～2种角度并结合环境因子进行分析。土壤微生物研究范围主要有土壤真菌、细菌、古细菌等。一般指受到人为或者自然干扰下，微生物的群落结构、优势种群消长、生理代谢、遗传变异与种群演替等规律。应用在土传病害研究中，主要指受到病原菌侵染后土壤微生物系统呈现出的一系列变化。土壤微生物系统是一个动态变化的系统，是通过自身遗传维持相对稳定的结构功能， 通过种群、代谢等变异应对外界干扰，共同构成土壤微生物系统对环境变化或干扰的抵抗力（resistance）和恢复力（resilience），维护土壤微生态系统的相对稳定状态[12-13]。通常来说，一个具有多样性与活性的微生物群落土壤往往具有较为丰富的土壤养分，这种土壤微生物群落结构，即可维护土壤生态系统的稳定性，也有利于提高土壤生态系统的缓冲能力。

2 土壤微生物多样性的研究方法

目前，土壤微生物生态系统研究大多停留在特征定性描述阶段，其定量表征研究处于刚刚起步发展阶段。随着土壤微生物多样性研究的日益深入，研究方法也在不断改进。主要包括传统的微生物平板培养法、土壤微生物生物量测定法、群落水平生理代谢分析法、磷脂脂肪酸PLFA分析法、基于核酸PCR扩增基础上的变性梯度凝胶电泳（DGGE）、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）以及近些年发展起来的高通量和高分辨率的宏基因组学、环境转录组学等。因每一种方法均有优缺点，加之土壤微生物的复杂性，采用单一方法往往不能够全面、准确地描述多样性状况[9-10]，对此，应尽可能结合多种方法展开研究。

2.1 传统生物平板培养法

传统的土壤微生物群落多样性研究方法主要为平板培养法，是对土壤微生物进行分离培养后，通过微生物的生理生化特征或特定的表现型进行分析鉴定。但该方法限于人为限定的培养条件，无法全面地估算微生物群落多样性，也难以定量描述土壤微生物的群落结构。据估计，每克土壤约有4×103～4×104种细菌[14]，而全球仅细菌种类就达20万～50万种[15-16]，且其中相当大一部分在实验条件下难以培养[17]；有学者认为传统的培养法仅能分离1%～10%土壤微生物[18]，甚至认为只能分离0.1%～1%土壤微生物[19-20]。此外，平板培养本身就是一个对微生物重新选择的过程，其结果并不能全面反映原始土壤微生物群落结构。可见，传统的培养技术难以客观、正确地反映包括土壤中微生物种别、种群大小、动态变化等许多重要参数，只有与其他先进方法结合起来，才能较为客观而全面地反映微生物多样性的真实信息，如Torsvik等[21]发现荧光显微计数精度就比传统培养法计数高100～1 000倍。

2.2 土壤微生物生物量测定法

土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5×103 μm3的生物总量，主要包括微生物碳、氮、磷[6，22]。土壤微生物生物量作为植物生长可利用的养分储存库，能敏感、及时地反映或预警土壤的变化，曾被用作综合评价土壤质量及土壤微生物活性强度的重要指标。有研究表明，施用无机氮的同时加施高C/N比的秸秆，可提高土壤中无机态氮被同化的水平，并通过土壤微生物生物量的固定，降低无机态氮淋失和挥发损失，进而提高氮肥的利用效率[23]。此外，土壤微生物生物量的变化还受植物生长状况、温度和湿度等环境因素的影响[24-28]。

土壤微生物生物量测定法主要包括直接镜检法、ATP分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法、熏蒸提取法。直接镜检法虽然较为原始，但作为最直接的土壤微生物量测定法，得到了广泛应用。其主要缺陷为一是技术难度大，易产生较大误差；二是操作复杂，要对不同种类微生物的个体大小进行测定，因此不适宜大批量样品的测定。ATP分析法的基本原理为：微生物的细胞受到外来物质破坏后，用合适的溶剂提取，采用荧光素-荧光素酶法测定提取液的ATP含量，最后换算成土壤微生物量。其缺点表现为：一，目前常用的三氯乙酸法[29]，ATP的提取率较低；二，土壤质地差异越大，微生物ATP含量有可能也随之变大，需要重新测定土壤微生物量和ATP之间的转换系数[30]；三，土壤磷素状况影响ATP测定的结果；四，费用昂贵、程序复杂，影响了方法的普及[29]。底物诱导呼吸法是基于由葡萄糖诱发的土壤最大呼吸率与土壤微生物量间的良好线性关系，通过底物（葡萄糖）诱导活的微生物呼吸放出CO2的量来间接测定微生物量。但是该方法容易受土壤含水量及酸碱度的影响。1976年，Jenkinso等[31]提出了熏蒸培养法，该法是根据被杀死的土壤微生物细胞因矿化作用而释放CO2的量激增来测定土壤微生物量，操作简单，误差小，适于常规分析。但该法存在一些弊端，如培养时间较长、不适用于强酸性土壤等。1985年，在熏蒸培养法的基础上提出了熏蒸浸提法，利用不同的浸提剂，通过氧化滴定法来测定土壤浸提液中可溶性有机碳含量，并依据与微生物量之间存在较稳定的比例关系，计算微生物量，该方法克服了熏蒸培养法及其它几种方法的局限，成为目前应用比较多的微生物量测定方法。

2.3 群落水平生理代谢分析法

群落水平生理代谢分析法是利用微生物对单一碳源吸收利用能力差异来区分不同微生物群落的方法，已经发展了几十年。早在1980年美国BIOLOG公司就生产出了BIOLOG微平板用于识别单一微生物群体。BIOLOG微平板主要有GN板、GP板、ECO板等，分别应用于革兰氏阴性好氧菌、革兰氏阳性好氧菌、微生物群落的特性分析。这几类板的研究对象主要为生长速度相对较快的好氧型微生物类群[32]。在微生物生态研究中应用最多的为ECO板[33]。BIOLOG微平板的基本原理为，将不同碳源和四哇盐染料装于平板内的小孔，微生物在利用碳源时会产生自由电子，自由电子与染料反应产生颜色变化，因利用碳源的种类和程度不同，颜色也有深浅之分，由此表征微生物群落结构的差异[34]。GN板、GP板、ECO板分别为95、95、31种碳源，并含有1个空白对照孔（不加碳源）。每个平板3次重复，原始数据为各孔吸光度。该法需要每隔12或24 h读数1次，连续读数7 d。3次重复的数据可以直接进行显著性分析。该法具有测定速度快，重复性高，系统性好等优点。

作为微生物群落水平上的生理特性分析法，目前BIOLOG微平板法已扩展到估算诸如碳源利用模式等微生物群落功能多样性的研究[35-37]、不同土壤及植物根际土壤微生物群落差异性的研究[38-39]、植物内生细菌群落多样性的研究[40]，以及转基因植物或外源微生物对植物根际土壤微生物群落的影响[41-43]。但该方法也有其不足之处，一是BIOLOG微平板法所描述的只是土壤中生长代谢快或富营养型等少部分细菌群落的活性，不能全面反映微生物群落信息[33，44]，其测定的土壤微生物种类数量远低于实际数量，甚至不到16S rDNA方法测定的微生物数量的1%；二是BIOLOG微平板中的碳源底物不能代表真實土壤中的碳源，因此它不能准确代表原生态系统中微生物的真实代谢多样性[44]；此外，BIOLOG微平板的测定结果还会受到微孔板的类型、土壤稀释液浓度以及稀释液中干扰物质的影响等。为全面可靠获得土壤微生物群落信息，可将BIOLOG微平板法与其它技术方法相结合起来使用。

2.4 磷脂脂肪酸（PLFA）分析法

磷脂约占细胞干重的5%，几乎是所有生物细胞膜的重要组成成分[45]。由于磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid）只存在于活体细胞膜中，且不同的磷脂脂肪酸含量相对恒定，因此它适用于评价微生物群落的多样性及监测微生物群落的动态变化[46]。基本流程为，用适当的提取剂先将土壤中磷脂脂肪酸提取出来，经甲基化后用气相色谱或气质联用检测，得到PLFA图谱，统计分析，即可判断出土壤微生物群落的多样性[47]。

目前，PLFA分析法被广泛应用到土壤微生物群落多样性和生物量的研究，如植被[48]、气候与季节[49-50]、肥料[23，51]、耕作方式[52]、土地利用方式[24，44]、有机污染物[53-54]、重金属污染[55]等。但PLFA分析法也存在不足之处。一是因不明确土壤中所有微生物的特征脂肪酸，PLFA方法不能用来分析土壤中部分单个菌株或种水平上的微生物；二是由于该法是利用标记过的脂肪酸来分析土壤微生物群落多样性，标记若有变动，将造成群落估算出现偏差；三是在不同环境条件下，细菌和真菌均能产生不同类型的磷脂脂肪酸，环境的改变有可能引起脂肪酸类型的改变[56]；四是耗时长，成本高，在实际应用中往往会受到一定的限制[57]。

2.5 分子生物学方法

近年来，基于微生物群落总基因组DNA提取方法的改进，利用微生物DNA进行数量及种类分析的技术得到长足发展，如克隆文库法、DNA杂交法、G+C含量法、基于聚合酶链式反应（PCR）的图谱分析法等。以PCR图谱为基础的分析法能够快速、批量比较多个样品间的微生物组成及变化。该方法主要包括：变性/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）、单链构象多态性（SSCP）、限制片段长度多态性/扩增核糖体DNA限制性分析（RFLP/ARDRA）、末端标记限制片段长度多态性（T-RFLP）、随机扩增多态性DNA/长引物随机扩增多态性DNA/基于高重复序列的PCR分析（RAPD/ERIC-PCR/rep-PCR）、（自动）核糖体基因间隔区分析（RISA/ARISA）。其中末端限制片段长度多态性是20世纪末应用于环境微生物方面的新方法，是一项综合运用PCR、DNA限制性酶切、荧光标记以及DNA序列自动分析的微生物群落分析方法，是通过测定特定核酸片段长度多态性来分析比较微生物群落的结构和功能[58]。具体操作如下：首先，获得所测样品的总DNA，以总DNA为模版，采用5端含有荧光标记的引物进行PCR扩增反应（常用的荧光引物有TET、HEX、6-FAM等），将扩增产物用合适的限制性内切酶进行消化，由于不同菌种的酶切位点不同，因此会产生长度不一的多种限制性酶切片段。采用DNA自动测序仪检测消化产物，获得峰值图。由于一种菌的末端带荧光标记片段（T-RF）长度是唯一的，且不同长度的T-RF片段均可被检测到，所以峰值图中每一个峰至少代表了一种菌[59-60]。测定结果是以峰的高度和面积表示微生物的种类和数量，以此反映待测微生物群落的组成及时空变化[61]。T-RFLP方法具有以下优点：（1）高通量。用于微生物的时空演替研究时，可以在短时间内产生大量精确、可重复的数据；（2）由于用于片段分析的软件已经提前设定好，可以快速标准化的统计分析数据，数据输出为表格形式，避免指纹图谱再数字化的程序；（3）通过与已知数据库中的T-RF片段比对，既能定性定量分析，又可直接鉴定到种；（4）精确度、分辨度高[51]；（5） 操作简单、实验周期短，工作量大为减少。因此，T-RFLP技术已被广泛用于分析各种环境（如土壤、水样、肠道等）微生物的群落结构及动态变化[10，62-65]。

然而该方法在实际应用中需要注意以下几个问题：（1）样品中微生物总DNA的提取和限制性内切酶的选择至关重要，试验前需根据试验目的，对不同待测样品的提取方法进行优化，以获得较高纯度的总DNA；（2）限制性内切酶的筛选是影响分析结果的关键因素，需综合几种酶切结果对多个图谱进行分析，提高检出效率。前期对常用几种酶进行筛选时发现，MSPI内切酶更合适于土壤微生物总DNA的酶切；（3） T-RFLP技术在检测片段时只检测含有荧光的比较端，但一个T-RF可能对应着2个以上菌种，导致检测的群落多样性较低。尽管T-RFLP技术还有些不足，但仍是目前研究微生物群落结构最常用的分析方法之一[58]。

2.6 高通量测序技术

高通量测序又称为“深度测序”或“下一代测序”技术，可实现一次性读取几十万到几百万条DNA 分子序列，可对样本进行全面细致分析。目前高通量测序平台主要有：454 Life Sciences公司的焦磯酸测序平台、Illumina Solexa的MiSeq和HiSeq测序平台以及Helicos Heliscope TM和Pacific Biosciences推出的单分子测序技术。对于土壤微生物多样性分析，以454焦磯酸测序平台和Illumina Solexa 的MiSeq测序平台应用最多。

454 Life Sciences公司检测原理就是依靠生物发光进行DNA测序。即在PCR反应过程中通过 DNA 聚合酶、双磷酸酶、荧光素酶的协同配合，实现每延伸一个碱基释放一次光信号[66]，测序平台通过对光信号获取和相关计算，得到待测DNA的碱基序列，实现实时测定 DNA 序列的目的。优点是读取片段长，可以对样本的基因组进行全面测序，通量较高。缺点是连续单碱基重复区的判断准确度不太高，价位偏高。

Illumina 公司的MiSeq测序平台是基于Illumina Solexa技术的第二代高通量测序技术平台，现已成为环境微生物研究的主要测序技术，原理与454 Life Sciences公司的基本一致，不同的是激发荧光信号的方式不是通过焦磷酸氧化荧光素，而是直接在 dNTP 上连接荧光基團和阻断基团[61]，也就是将小片段DNA连接在固相上，通过桥式PCR扩增成单分子簇，达到所需模板量后，将带有特异荧光碱基（dNTP）加入反应体系，进而激发dNTP上荧光基因。该方法的优点是检测通量高、价格低；缺点是片段相对较短，序列质量不稳定，有阅读偏差，目前已成为土壤微生物研究的主要手段。

3 土壤微生物多樣性研究在土传病害防治中的应用与展望

近几十年来，中国农业迎来了突飞猛进的发展，作物产量和质量显著提高，这归功于农业科技的进步，但化肥农药的过量施用，带来了耕地质量下降，土传病害频发问题。在香蕉枯萎病田间调查中发现，土壤有机质丰富、pH值偏中性的土壤，枯萎病发生较轻，反之，枯萎病发生严重。通过对健康和发病土壤微生物进行比较，发现健康土壤微生物多样性更丰富，特别是有益菌如芽孢杆菌、链霉菌相对数量较多，病原真菌的数量相对较少[67-68]。将环境因子与香蕉园土壤微生物做关联分析发现，一些特定的营养元素如硼、锌、磷等与枯萎病的发生有一定的相关性，但不同类型的土壤营养元素相关性却不同。田间调查还发现，用杀真菌的药剂进行枯萎病防治效果较差，用杀细菌药剂处理后，枯萎病的发生明显降低。这可能是由于枯萎病病原菌大量繁殖的同时引发特定种类细菌数量的增加，使用杀细菌药剂在一定程度上降低细菌数量，与细菌数量有正相关关系病原真菌数量也将随之降低。除枯萎病外，其他土传病害中土壤微生物种类及多样性与病害发生为何种关系，有待进一步探究。

可将中医综合调理理论应用于土传病害防治，即从土壤、植物微生态系统平衡角度，构建有益微生物与病原菌之间的和谐平衡系统，同时增强植物本身的抗病性（免疫力）。但何为平衡的土壤微生物生态系统？如何构建健康的土壤微生物生态系统？不同作物种类、气候条件、土壤类型，土壤微生物生态系统会有显著不同，同时也会有一定的规律，即相同点。如何通过大量调查分析，总结出相同点与不同点，然后根据不同作物和土壤进行“号脉”、“抓药”，有的放矢的对病害进行生态防控，已成为土传病害防控亟要解决的首要问题。

土壤微生物群体庞大，由于研究目的、土壤环境、研究对象不同，会导致研究结果不同。要想更全面了解土壤微生物的多样性，需将上述几种研究方法结合起来使用。如：张秋芳等[69]为了解烤烟施肥技术对土壤微生物群落多样性的影响，应用磷脂脂肪酸（PLFA）法，结合聚类分析，揭示土壤微生物群落功能的动态变化。张重义等[70]采用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术和传统平板培养的方法，研究地黄连作下根际土壤细菌群落的动态变化。张志红等[67]采用 Biolog Eco 微平板和传统平板培养的方法，研究不同肥料对土壤微生物功能多样性影响。周登博[68]采用Biolog 和T-RFLP 的方法，探索了拮抗菌饼肥发酵液与土壤消毒剂对香蕉枯萎病的防控效果及对土壤微生物的影响。总之，不管采用何种研究方法，传统分离培养法因可通过肉眼可见方式认识微生物资源的丰富性，成为土壤微生物研究不可或缺的方法之一，同时现代分子生物学的发展也为揭示土壤微生物奥秘的提供了新途径。然而土壤微生物环境的复杂性决定了目前并不能准确了解土壤中到底存在多少微生物？尤其是特定微生物种群的具体数量。当前土壤微生物研究也只是局限在植物、微生物、土壤之间的互作，将物理、生化因素作为系统研究较少。因此，土壤微生物研究方法还需不断改进和创新。而土壤微生物种群的多样性是土壤性状最重要的组成部分之一，因此，在大力倡导化肥农药减施增效的大背景下，通过正确合理措施，如施用微生物菌肥、菌剂、有机肥替代部分化肥，调节和改善土壤的微生物生态结构和多样性，必定将成为未来有机农业的重要发展方向之一。

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