肝素体外诱导血小板聚集的相关性研究

2018-06-21巫小莉张玲肖鸿岸陈倩礼周碧云

实验与检验医学 2018年3期

巫小莉，张玲，肖鸿岸，陈倩礼，周碧云

(1、广州金域医学检验中心，广州51000；2、广州中医药大学金沙洲医院，广州510168)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 Sysmex XN－1000全自动血液分析仪；配套试剂；校准物名称：XN－CAL，批号：63130525、质控物批号：63611101、63611102、63611103；广州阳普科技医疗股份有限公司：2mg/ml EDTA－K2抗凝管：批号 161119；20IU/ml肝素锂抗凝管：批号：161010；3.8%枸橼酸钠抗凝管：批号：170119；奥林巴斯BX－43双目显微镜；贝索企业：瑞氏－姬姆萨染液；

1.1.2 标本来源新鲜血标本来自广州中医药大学金沙洲医院门诊病人及健康体检者。

1.2 方法

1.2.1 仪器的准备按《中华人民共和国卫生行业标准WS/T406－2012》临床血液学检验常规项目校准操作要求进行校准。各项指标均达到国家行业标准。

1.2.2 质控每天质控（高、中、低）数据均在±2SD范围之内；

1.2.3 标本选取本院近三个月内没有用过肝素或其他抗凝治疗的临床标本共102例，其中82例用于EDTA－K2与肝素抗凝血的血小板计数比对；20例体检标本用于不同浓度肝素的血小板计数及MPV的比对。同步进行涂片染色显微镜观察。

1.2.4 实验操作每例同时抽血3管：2mg/ml EDTA－K22ml、20IU/ml肝素锂管抽血 5ml、50IU/ml肝素锂管抽血2ml，分别进行血小板计数，同步涂片观察血小板分布情况。试验于抽血后15min开始，两小时内同步完成测试。

1.2.5 正常人的枸橼酸钠抗凝血2管，1000rpm离心5min，吸取富含血小板血浆（PRP），其中一管加入肝素，另一管不加肝素，混匀放置数分钟后分别涂片染色，在镜下观察血小板分布情况。

西芳寺原是作为圣德太子别墅而建的寺院，于1339年重建为禅宗寺院，是日本最古老的庭园之一，也是日本枯山水庭园的开山之作，由日本枯山水鼻祖、禅学国师梦窗疏石设计建造而成，融合了禅宗中幽玄、素朴、自然、清静等理念，已被列入世界文化遗产。日本的枯山水园林即由细沙碎石铺地，表示“水”，一些叠放有致的石块表示“山”，再添加苔藓、草坪或其他自然元素，以此组成的缩微式园林景观。西芳寺满园生长有100多种苔藓植物，庭园分为上、下两段，上段庭园为枯山水园林，下段为平地的池泉回游式庭园。

1.2.6 统计学方法数据处理采用 SPSS 13.0软件包统计。

2 结果

2.1 82例EDTA－K2抗凝血与肝素锂抗凝血的血小板计数，肝素锂抗凝血的血小板数明显低于EDTA－K2抗凝血的血小板数，有非常显著性差异，P＜0.01。数据显示，肝素锂抗凝的血小板计数量的下降速度存在个体差异，不同个体的血小板出现不同的聚集状，有簇状、小簇状、大簇状，甚至成堆聚集。见图1、表1。

表1 EDTA-K2抗凝血与肝素锂抗凝血血小板计数比较

图1 EDTA与不同浓度肝素抗凝血血小板镜下分布图（×1000）

2.2 20例不同浓度肝素抗凝血 20IU/ml肝素锂管和50IU/ml肝素锂管的血小板计数，高浓度肝素血小板数明显减少，有非常显著性差异（P＜0.01）。见表2。

表2 不同浓度肝素抗凝血血小板计数比较

图2 EDTA、肝素20IU与肝素50IU血小板计数比对（误差条形图：95%CI）

2.3 20例体检标本中，肝素抗凝的MPV较EDTAK2抗凝大，50IU/ml肝素抗凝的MPV较20IU/ml肝素抗凝大，肝素浓度越高MPV越大，呈正相关，镜下观察血小板有肿胀现象，统计学有非常显著性意义（P＜0.01）。见表 3。

表3 EDTA-K2抗凝血与不同浓度肝素锂抗凝血MPV比较

2.4 两管富含血小板血浆（PRP），一管加入肝素，另一管不加肝素，混匀放置数分钟后分别涂片染色，在镜下观察血小板分布情况，加入肝素的那一管血小板有聚集现象，见图3。不加肝素的那管血小板呈星状散在分布，见图4。

图3 PRP（有肝素）（×1000）图4 PRP（无肝素）（×1000）

3 讨论

在体外，肝素可以诱导血小板聚集。表1结果显示：同一条件下，EDTA－K2抗凝血与肝素抗凝血的血小板计数有非常显著性意义，P＜0.001。图1示显微镜下，肝素抗凝血涂片可见血小板聚集呈小簇状、大簇状或成堆分布，而EDTA－K2抗凝血的血小板呈星状分布。表2结果显示，高浓度肝素抗凝血的血小板计数降低幅度较低浓度肝素的明显，两者血小板计数有非常显著性意义，P＜0.01；临床亦有报导接受肝素治疗的患者，严重出血与治疗剂量之间有明显关系，接受5mg和10mg剂量的患者出血事件的发生率均较高，接受最小剂量2.5mg的患者，出血发生率低于随机接受华法林的患者(P=0.029)[11－14]，说明不论体外试验或体内治疗，均受肝素浓度的影响。

为了确定肝素有无诱导血小板聚集的作用，研究小组进行了补充实验：采集正常人的枸橼酸钠抗凝血2管，1000rpm离心5min，吸取富含血小板血浆（PRP），其中一管加入肝素，混匀放置数分钟后分别涂片染色，在镜下观察血小板分布情况，结果显示，加入肝素后血小板有聚集现象，见图3；不加肝素的血小板则呈散在的星状分布，见图4，结论：肝素可在体外诱导血小板聚集。而Williams等的研究表明普通肝素可以直接激活血小板，增加血小板的聚集力[17]，实验结果也证实了这一点。

此外，实验数据和在显微镜下观察到的血小板聚集的情况显示，即使同剂量的肝素抗凝血样本在显微镜下观察，有的血小板聚集成大簇状，甚至聚集成堆，有的样本则形成小簇状聚集。数据方面也是一样，有些变化很大，有些则没太大的变化，可能是因为肝素带有负电荷可以与各种血浆蛋白结合，不同水平的蛋白可导致肝素的不同效果差别[2－18]。

根据文献描述，体内肝素诱导血小板聚集应属于非免疫性结合，肝素与血小板第四因子（PF4）结合是目前普遍接受的可能原因。临床上肝素诱导的血小板减少症（HIT）分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型较常见，原因不明，是一种良性的非免疫反应，可能与肝素直接激活血小板相关。[10－13]。肝素体内发生的Ⅰ型反应与直接激活血小板相关，而肝素体外诱导血小板聚集，也是肝素直接激活血小板而发生，两者之间是否存在关联性值得探讨。

英国血小板输血指南中明确指出肝素引起的免疫性血小板减少症是血小板输注禁忌证，即真正的HIT是不能通过输注血小板治疗的，因其反馈机制会导致更严重的血栓栓塞并发症[11]。假设肝素引起的免疫性血小板减少症并不是真正的血小板减少，而是血小板发生聚集造成的假性减少，此时如果输注血小板会加速血小板聚集，导致严重的微循环血栓栓塞。假设是否成立，需待进一步做相关实验验证。

血透患者维持性血液透析(Maintenance haemodialysis，MHD)由于需要反复高频次的使用肝素，因此更具有发生HIT的风险[3]。更有文献研究发现：约38%～78%HIT患者形成血栓，其中截肢10%，20%～30%的患者一个月内死亡[12]。血液透析过程与肝素体外诱导血小板聚集试验具有相似性，体内肝素治疗后引起血小板的一系列反应或许与肝素在体外能诱导血小板聚集有相关，问题值得进一步思考和研究。当然，体外试验用的是普通肝素，而体内治疗用的是低分子肝素，两者作用不能相提并论，我们可以从中得到启示。

实验数据与大量的临床资料说明，肝素在体外、体内均可诱导血小板聚集。通过体外实验的启示，有必要对肝素抗凝原理进行重新认识和探讨。

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