血清中IGF-1及PI3K/Akt信号通路在PCOS患者体内表达的变化及意义

李丽华

(许昌市妇幼保健院妇保科，河南 许昌 461000)

多囊卵巢综合症（polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种生育年龄妇女常见的生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合症[1]。主要临床表现为月经周期不规律、不孕、多毛或痤疮，是最常见的女性内分泌疾病。目前PCOS的发病机制尚未明确，近年来发现PCOS患者存在不同程度的胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），胰岛素抵抗会引起高胰岛素血症，从而导致子宫内膜的异常增生甚至癌变[2]。体外试验证实，胰岛素可促进子宫内膜癌细胞增殖，加速癌细胞进展[3]。研究表明，卵巢胰岛素抵抗的本质是胰岛素样生长因子(insulin－like growth factor，IGF) 分裂信号的级联放大及组织反应性升高，导致胰岛素受体底物（IRS）表达异常[4]，IRS通过激活P13K/AKT通路促进细胞增殖和合成代谢。P13K/AKT通路是参与体内糖脂代谢的重要病理生理机制，激活的胰岛素受体能够通过聚集并磷酸化各种底物蛋白（IRS）而激活细胞内的P13K/AKT通路。本研究通过检测多囊卵巢综合征（PCOS）患者IGF-1、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）的表达及意义，旨在为PCOS的诊治提供临床依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年2月至2017年2月在河南省许昌市妇幼保健院治疗的PCOS患者100例，其中不存在胰岛素抵抗（IR）患者57例（A组），存在IR患者43例（B组），纳入标准：⑴诊断符合2003年欧洲人类生殖和胚胎学会和美国生殖医学会制定的标准[4]；⑵患者及家属知情同意并签署同意书。排除标准：⑴近3个月使用过激素类药物；⑵合并有甲状腺功能异常、肾上腺疾病等其他内分泌疾病。同时选取非PCOS患者60例作为对照组 （因输卵管因素不孕经前或卵巢良性肿瘤术前行诊刮术者）。

1.2 实验方法

1.2.1 胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、IGF-1含量测定 患者过夜禁食10h后，在次日清晨8时抽取静脉血2ml，3500r/min离心15min，分离上层血清置于-20℃冰箱待测。使用葡萄糖氧化酶法测定患者空腹血糖（FBG）水平，使用ELISA法测定空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)水平并计算 HOMA-IR，计 算 公 式 ：HOMA-IR=FINS×（FBG/22.5）。 使 用ELISA方法测定人血清IGF-1含量，试剂盒购自Sigma-aldrich公司。所有操作步骤均按试剂盒说明书进行。

1.2.2 标本采集和PI3K-Akt通路表达检测 患者在月经来潮后的12h以内采集子宫前后壁的新鲜内膜组织，取得组织存放于无菌冻存管后移至-80℃冰箱保存待用，行Western Blotting检测。

Western Blotting检测主要步骤：冰浴条件下使用细胞裂解液提取子宫内膜的总蛋白，BCA方法测定总蛋白的浓度，自动酶标仪读取数据。制备分离胶，浓度为10%。上样取既定样品蛋白质50μg。积层胶所加电压为80V，SDS-PAGE采用10%分离胶恒压120V分离目的蛋白；恒流300mA转膜1h；含5%脱脂奶粉的TBST溶液4℃封闭过夜；孵育一抗，1×TBST室温下洗膜三次，一抗稀释比例为1：1000（Akt、p-Akt兔源单克隆抗体购自美国CST公司），4℃摇床过夜；孵育二抗，1×TBST室温下洗膜三次，二抗稀释比例为1：5000，摇床室温下孵育1h（HRP标记的羊抗兔IgG，美国Zymed Laboratories）。使用增强化学发光(ECL)试剂盒发光显影。胶片经凝胶成像系统扫描成像、分析，以各指标与内参照的比值表示其相对表达水平。兔抗人PI3K﹑内参照为β肌动蛋白(β-actin)兔源多克隆抗体，均购自美国Abcam公司。所有操作按照说明书进行操作。

1.3 统计学处理 统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料采用（±s）表示，组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD检验。相关分析采用Pearson分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组年龄、血清IGF-1水平比较 三组受试者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）；A组和B组患者 IGF-1、HOMA-IR、FBG和 FINS明显高于对照组 （P＜0.05）；B 组患者 IGF-1、HOMA-IR、FBG和FINS明显高于A组（P＜0.05）。见表1。

2.2 三组子宫内膜PI3K、Akt及p-Akt表达比较A组和B组患者子宫内膜PI3K、Akt和p-Akt明显高于对照组（P＜0.05）；B组患者子宫内膜PI3K、Akt和 p-Akt明显高于 A 组 （P＜0.05）。 见图 1，表2。

2.3 相关性分析 将 PCOS患者 IGF-1、PI3K、Akt和p-Akt表达量与HOMA-IR进行Pearson相关分析， 结果显示：PCOS患者 IGF-1、PI3K、Akt和 p-Akt表达量与 HOMA－IR 呈正相关（r=0.321、0.336、0.401 和 0.366，P＜0.05）。见表 3。

表1 三组年龄、血清IGF-1、HOMA-IR、FBG及FINS水平比较（±s）

表1 三组年龄、血清IGF-1、HOMA-IR、FBG及FINS水平比较（±s）

注：a表示与对照组比较P＜0.05；b表示与A组比较P＜0.05。

组别 例数A组B组对照组57 43 60 F P年龄（岁） IGF-1（ng/ml） FBG（mmol/L） FINS(mU/L) HOMA-IR 30.01±4.38 29.64±3.20 30.12±5.22 2.044 0.103 432.28±87.39a 489.01±90.44ab 281.04±75.29 64.291＜0.001 6.14±1.43a 7.55±1.50ab 5.41±0.89 23.104＜0.001 7.35±1.16a 12.60±1.26ab 4.99±0.94 30.573＜0.001 2.04±0.84a 3.91±0.91ab 1.20±0.74 42.011＜0.001

表2 三组血清PI3K、AKT及p-Akt表达量比较（±s）

表2 三组血清PI3K、AKT及p-Akt表达量比较（±s）

注：a 表示与对照组比较P＜0.05；b 表示与 A 组比较P＜0.05。

0.7 1 3±0.1 2 3 a 1.1 0 1±0.1 1 2 ab 0.4 0 6±0.1 0 3 2 0.0 6 3＜0.0 0 1组别A组B组对照组例数4 3 5 7 6 0 F P P I 3 K表达量 A k t表达量 p－A k t表达量0.8 9 1±0.1 1 2 a 1.1 0 2±0.1 8 1 ab 0.5 4 1±0.1 0 4 2 2.0 3 3＜0.0 0 1 0.8 1 2±0.1 2 0 a 1.2 0 4±0.2 4 ab 0.4 2 2±0.1 0 1 2 5.2 8 1＜0.0 0 1

图1 Western blot检测图

表3 IGF-1、PI3K、Akt和p-Akt表达量与HOMA-IR相关分析结果

3 讨论

多囊卵巢综合症（polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合症，是生育期妇女月经紊乱最常见的病因[5]。POCS的发病机制尚不明确，其病理生理过程涉及了机体包括糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢等多种代谢途径异常[6]。其中糖代谢异常主要表现为胰岛素抵抗，导致PCOS患者代偿性高胰岛素血症。Arduc等[7]研究发现，PCOS患者普遍存在不同程度的IR，同时当IR伴有高胰岛素血症时，会大大增加子宫内膜增生甚至癌变的几率。本研究结果显示，PCOS患者HOMA－IR明显高于正常人（P＜0.05），同时存在 IR 的 PCOS 患者 HOMA－IR明显高于不存在 IR 的 PCOS 患者（P＜0.05），这与以上报道结果相符。

胰岛素样生长因子1（IGF－1）是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽类蛋白物质[8]。IGF－1主要在肝脏中合成与表达，它可以促进机体有丝分裂，参与机体的新陈代谢等多种代谢途径。本实验中PCOS患者的血清IGF－1浓度高于正常人，并且存在IR的PCOS患者的血清IGF－1浓度高于不存在 IR 的 PCOS 患者（P＜0.05），提示 IGF－1 参与了PCOS的发病过程，并且与IR存在一定关系。其机制可能为，IGF－1促进卵巢雄激素的生物合成。PCOS病人因IGF－1的过度作用，引起卵泡膜闻质细胞的LH受体增加，卵巢对于黄体生成素的敏感度增加导致卵泡募集，抑制优势卵泡的发育，促进了卵泡的闭锁[9]。Brazert M等[10]研究发现，PCOS患者IGF－1水平明显高于正常人。高胰岛素血症可抑制肝脏合成胰岛素生长因子结合蛋白 (IGFBP－1)，游离的IGF－1增多导致机体的高胰岛素环境，进一步加剧IR，促进多囊卵巢形成。陈巍等[11]发现IGF－1在PCOS大鼠模型中呈高表达，其检测对人类PCOS的诊断及发病机制研究具有重要参考价值。这也提示可以从阻断IGF－1的作用入手来开辟一种新的PCOS治疗途径。

PI3K/AKT通路在肿瘤和炎性反应的发生、发展过程中发挥着重要作用[12]。有研究报道，在骨肉瘤、卵巢上皮癌及肾肿瘤等多种恶性肿瘤中都发现有PI3K/Akt的过度表达[13]。由于胰岛素主要通过PI3K/Akt信号通路调节代谢，而大多数PCOS患者存在IR，会导致PI3K－AKT信号通路功能失调。PCOS患者子宫内膜上皮细胞内的Akt过度磷酸化可以导致子宫内膜上皮不典型增生，He H[14]等研究发现，PI3K/AKT通路参与调节细胞增生和子宫内膜自身稳态调节。本结果发现，PCOS患者子宫内膜p－Akt表达比正常子宫内膜患者水平升高，存在IR患者子宫内膜组织中p－Akt蛋白的表达水平明显高于不存在胰岛素抵抗（IR）患者。提示胰岛素P13K/Akt信号通路的过度活化，即p－Akt的过度表达参与了PCOS的发生和发展过程。通过相关性分析，PCOS患者 IGF－1、PI3K和 Akt表达量与HOMA－IR呈正相关。表明PCOS患者血清IGF－1、子宫内膜中PI3K和Akt水平明显升高，可能与PCOS患者胰岛素抵抗有一定的关系，值得进一步研究。C Palladino等[15]研究显示，胰岛素抵抗的PCOS中，PI3K/Akt信号通路过度的表达是PCOS患者子宫内膜过度增生和发生癌变的基础。本结果中，PCOS患者的血清IGF-1浓度也高于正常人，因此分析PCOS患者PI3K/Akt的原因可能为，PCOS患者大多存在IR和高胰岛素血症，导致子宫内膜组织增生，加之高胰岛素血症的刺激，IGF与细胞膜上胰岛素及胰岛素样生长因子受体结合，受到激活的受体会导致胰岛素受体底物的酪氨酸残基磷酸化，从而激活细胞内的PI3K/AKT/GSK3通路。

综上所述，PCOS患者血清IGF-1、子宫内膜中PI3K和、Akt和 p-Akt水平明显升高，可能与PCOS患者胰岛素抵抗有一定的关系，PI3K-Akt信号通路的研究不仅能帮助了解PCOS的发病机制，同时也有望开辟治疗PCOS的新途径，值得进一步研究。

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