H2S对脓毒症大鼠急性肾损伤保护作用及机制研究

卜克，王璐，王伟，张晶芳，刘林刚

(郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450052)

脓毒症作为各种因素导致的全身性炎性反应综合症，可累及多个系统和器官，是导致患者死亡的重要因素[1]，其中脓毒症患者继发急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是常见的严重并发症，发生率高达40%～70%[2]，死亡率更是超过了70%[3]，严重威胁患者生命安全。有研究指出，若能早期发现并采取有效措施阻止脓毒症继发AKI患者肾功能不可逆性损伤，可减少患者死亡。硫化氢（hy-drogen sulfide，H2S）作为一种新型气体信号分子，具有多种生物学活性，与多种疾病发生密切相关[4]，可通过抗炎、抑制氧化应激反应而减少机体损伤[5]，有研究指出[6]，H2S可通过抑制氧化应激减轻肾脏缺血再灌注损伤。本研究拟探讨外源性补充H2S对脓毒症大鼠AKI保护作用，并探讨可能的机制，以期为临床早期干预脓毒症继发AKI提供基础资料。

1 资料与方法

1.1 主要仪器与试剂 凝胶电泳影像分析系统（美国 Bio－rad）；脂多糖（LPS，规格 10mg）和 NaHS（美国 Sigma 公司）；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；白细胞介素－1β（IL－1β）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）检测试剂盒（美国R&D公司）；HE染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；TUNEL试剂盒 （美国Roche公司）；兔抗鼠Caspase－3多克隆抗体（美国CST公司）；兔抗大鼠 Bcl－2、Bax单克隆抗体 （美国 Santa Cruz公司）。

1.2 实验动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠40只购自河南省实验动物中心 （合格证号：SCXK（豫）2010－0002），6～8 周龄，体重（200±20）g，饲养于标准实验室，自由进食、饮水。所有动物编号后，利用随机数字表随机分为假手术组、模型组、生理盐水组和H2S干预组，每组10只。

1.3 大鼠脓毒症急性肾损伤模型制备及分组处理参照文献[7]中介绍的盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肾损伤模型。取各组大鼠，禁饮禁食10h，利用10%水合氯醛腹腔麻醉，取仰卧位固定，备皮消毒，取腹中线切口开腹，将肠系膜和盲肠充分游离后，用4号无菌丝线在回盲瓣以下进行环形结扎，使用20号针头在盲端部进行贯通穿孔，挤出少量粪便后，放回腹腔，关腹，逐层缝合。以术后30min时出现精神萎靡、活动减少、毛发失去光泽、呼吸急促、喜饮水、解稀便作为模型成功标志。假手术组麻醉后开腹翻动肠道后即关腹。H2S干预组于造模后30min按10mg/kg剂量腹腔注射NaHS，生理盐水组按同样的方法给予等量生理盐水。整个实验过程中各组大鼠未出现死亡。

1.4 各组大鼠血清中Scr和BUN水平检测 各组大鼠于造模12h后，采集各组大鼠股动脉血，3000r/min离心15min分离血清，利用全自动生化仪对血清中Scr和BUN水平进行检测。

1.5 各组大鼠肾脏组织病理学观察 各组大鼠于造模12h后，处死，将双侧肾脏摘除，将右肾快速保存于－70℃液氮中，取部分左肾组织，4%多聚甲醛固定后，梯度酒精脱水，石蜡包埋后，切片，HE染色，利用光学显微镜进行观察。

1.6 各组大鼠血清和肾脏组织中 MDA、SOD、IL－1β、TNF－α水平检测 采集各组大鼠股动脉血，3000r/min离心15min分离血清，取部分右肾组织，用预冷生理盐水制备组织匀浆，4℃下于3500r/min离心20min，留取上清液。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法分别检测血清和肾脏组织中MDA、SOD、IL－1β、TNF－α 水平，所有操作均在标准实验条件下，按试剂盒说明完成操作。

1.7 TUNEL法检测各组大鼠肾脏组织中细胞凋亡取各组大鼠肾脏组织石蜡标本，切片后，脱蜡水化，利用柠檬酸钠缓冲液微波120s进行抗原修复，3%双氧水处理4min，用PBS清洗 3次，加入TUNEL试剂，于37℃下孵育90min，加入3%甲醛－H2O2溶液阻断 15min，加入 POD 转换液 50μl，37℃孵育25min，用PBS清洗3次，DAB显色6min，苏木素复染，制片后用光学显微镜进行观察，拍照，随机取10个高倍视野计数阳性细胞数，计算细胞凋亡率=（阳性细胞数/细胞总数）×100%。

1.8 Western blot法检测各组大鼠肾脏组织中Caspase－3、Bcl－2、Bax 蛋白表达 取部分右肾组织，剪碎后研磨，加入细胞裂解液裂解，提取总蛋白，用BCA总蛋白检测试剂盒检测蛋白纯度并定量。取30μg总蛋白，进行SDS－PAGE电泳，电转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温下封闭120min，分别将一抗兔抗鼠Caspase－3多克隆抗体、兔抗大鼠Bcl－2、Bax 单克隆抗体加入（稀释比例：1：1200、1：800、1：1000），4℃下过夜孵育，用 TBST 冲洗 3 次，加入二抗，室温下孵育120min，用TBST冲洗3次，加入ECL化学发光试剂避光反应20min，拍照，利用Image J图像分析软件对各组大鼠肾脏组织中Caspase－3、Bcl－2、Bax 蛋白相对表达量进行分析。

1.9 统计学分析 采用SPSS 21.0统计分析软件完成数据整理分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD－t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中Scr和BUN水平 与假手术组相比，模型组、生理盐水组和H2S干预组大鼠血清中Scr和BUN水平均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），与模型组和生理盐水组相比，H2S 干预组大鼠血清中Scr和BUN水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见表 1。

表1 各组大鼠血清中Scr和BUN水平比较（n=10，±s）

表1 各组大鼠血清中Scr和BUN水平比较（n=10，±s）

注：与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与生理盐水组相比，cP＜0.05。

BUN（mmol/L）5.97±0.37 30.15±4.28a 29.13±4.17a 17.29±4.98abc 74.086 0.000组别假手术组模型组生理盐水组H2S干预组F P Scr（μmol/L）39.54±5.83 128.65±12.37a 131.28±13.16a 78.32±9.14abc 172.066 0.000

2.2 各组大鼠肾脏组织病理学变化 HE染色结果显示，假手术组大鼠肾脏组织中细胞排列规则、结构完整，胞核居中、核仁清楚，细胞质染色均匀，未发生变性、坏死，肾小球形态未发生改变；模型组和生理盐水组大鼠肾脏组织中肾小管上皮细胞出现肿胀、水样变性、空泡变性，肾小管出现扩张、其间可见脱落细胞，肾间质出现充血水肿，出现肾小球炎表现；与模型组和生理盐水组相比，H2S干预组大鼠肾脏组织损伤减轻，细胞异常减少，间质充血水肿减轻，详见图1。

2.3 各组大鼠血清和肾脏组织中 MDA、SOD、IL－1β、TNF－α水平 与假手术组相比，模型组、生理盐水组和H2S干预组大鼠血清和肾脏组织中MDA、IL－1β和TNF－α水平均升高，而SOD水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组和生理盐水组相比，H2S干预组大鼠血清和肾脏组织中MDA、IL－1β和TNF－α水平均降低，而SOD水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见表 2。

图1 各组大鼠肾脏组织病理学变化（A：假手术组；B：模型组；C：生理盐水组；D：H2S 干预组，HE×400）

2.4 各组大鼠肾脏组织中细胞凋亡情况 假手术组大鼠肾脏组织中偶见凋亡的肾小管上皮细胞，细胞凋亡率（5.2±1.4）%，与假手术组相比，模型组、生理盐水组和H2S干预组细胞凋亡率均升高，分别为（21.6±4.8）%、（22.8±5.6）%和（11.5±2.7）%，差异有统计学意义（F=60.374，P=0.000），与模型组和生理盐水组相比，H2S干预组细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠肾脏组织中 Caspase－3、Bcl－2、Bax蛋白表达 与假手术组相比，模型组、生理盐水组和H2S干预组大鼠肾脏组织中Caspase－3、Bax蛋白相对表达量均升高，而Bcl－2蛋白相对表达量降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组和生理盐水组相比，H2S干预组大鼠肾脏组织中Caspase－3、Bax蛋白相对表达量均降低，而 Bcl－2 蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见表3和图2。

3 讨论

脓毒症作为重症监护室患者首要的致死性疾病，发病率较高且呈逐年上升趋势[8]，严重威胁人类生命健康。目前，脓毒症发生机制尚未完全清楚，且发病过程中可导致多器官损伤，其中，AKI是常见的并发症，且病情危重，临床治疗效果不佳，具有较高的致死率[9]。H2S作为继NO、CO后又一种新型气体信号分子，已被发现在机体多个系统中发挥重要生理调节作用[10]，在抗炎、抗氧化应激反应中发挥重要作用，对抗细胞凋亡、保护重要器官具有重要意义[11]。张颖等[12]指出，H2S作为一种内源性介质可通过作用于线粒体调节能量代谢而减轻截止创伤导致的大鼠肾结构和功能损害。许武军等[13]等指出，内源性H2S通过抑制NF－κB表达而减轻尿源性脓毒血症肾损伤。本研究利用经尾静脉注射LPS的方法建立大鼠脓毒症模型，HE染色结果显示，模型组大鼠肾脏组织中肾小管上皮细胞出现肿胀、水样变性、空泡变性，肾小管出现扩张、其间可见脱落细胞，肾间质出现充血水肿，出现肾小球炎表现，同时，模型组大鼠血清中Scr和BUN水平均升高，说明脓毒症大鼠发生了AKI，模型构建成功。

表2 各组大鼠血清和肾脏组织中MDA、SOD、IL-1β、TNF-α水平比较（n=10，±s）

表2 各组大鼠血清和肾脏组织中MDA、SOD、IL-1β、TNF-α水平比较（n=10，±s）

组别 血清M D A（n m o l/L）假手术组模型组生理盐水组H 2 S干预组F P 5.0 8±0.7 5 1 2.8 5±1.1 7 1 3.0 6±1.2 1 8.9 5±0.8 2 1 4 8.6 4 1 0.0 0 0肾脏组织3.7 2±0.8 1 7.3 2±0.9 9 7.2 7±0.8 5 5.9 1±0.9 6 2 5.0 1 8 0.0 0 0 S O D（U/m L）I L－1 β（n g/L）血清 肾脏组织 血清 肾脏组织 血清 肾脏组织1 6 6.7 2±1 2.0 7 1 0 9.6 5±1 1.8 6 1 1 1.3 4±1 2.0 5 1 3 2.8 6±1 1.4 3 5 0.3 4 4 0.0 0 0 T N F－α（n g/L）M D A（n m o l/L）8 4.1 7±1 3.9 8 4 0.3 8±1 1.6 4 3 9.2 7±1 0.5 9 6 0.2 6±9.6 2 4 4.2 9 0 0.0 0 0 4 8.2 4±5.6 8 1 0 8.3 5±1 0.5 7 1 1 2.5 2±1 2.8 6 7 3.2 8±8.9 7 1 0 5.7 8 3 0.0 0 0 7 8.9 5±1 0.2 8 3 6 8.2 5±1 6.1 7 3 5 9.9 2±1 3.9 4 1 0 2.3 6±9.5 3 1 8 6 1.3 8 6 0.0 0 0 6 7.2 8±4.0 9 9 5.1 5±5.3 7 9 8.2 6±5.7 2 8 0.3 1±4.4 2 6 6.3 5 2 0.0 0 0 1 0 8.3 6±6.1 7 1 5 2.2 7±7.9 8 1 5 7.1 6±8.1 8 1 2 9.3 5±6.5 2 6 9.1 6 2 0.0 0 0

表3 各组大鼠肾脏组织中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达比较（n=10，±s）

表3 各组大鼠肾脏组织中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达比较（n=10，±s）

注：与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与生理盐水组相比，cP＜0.05。

0.2 6±0.0 8 0.6 2±0.1 0 a 0.6 0±0.0 7 a 0.4 3±0.1 4 abc 3 8.9 9 1 0.0 0 0组别假手术组模型组生理盐水组H 2 S干预组F P C a s p a s e－3 蛋白0.3 4±0.1 1 0.8 0±0.1 6 a 0.7 8±0.1 3 a 0.5 1±0.1 2 abc 1 2.1 1 5 0.0 0 0 B c l－2 蛋白 B a x蛋白0.7 2±0.1 5 0.3 1±0.0 9 a 0.3 3±0.1 0 a 0.5 4±0.1 1 abc 4 9.7 2 1 0.0 0 0

图2 各组大鼠肾脏组织中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达

本结果显示，与模型组和生理盐水组相比，H2S干预组大鼠血清中Scr和BUN水平均降低，HE染色结果显示，H2S干预组大鼠肾脏组织损伤减轻，细胞异常减少，间质充血水肿减轻，说明给予H2S干预后，可有效减轻脓毒症AKI大鼠肾组织损伤。MDA作为脂质过氧化的终产物，是反映机体组织、细胞等受氧化应激损伤严重程度的标志物，SOD作为一种保护性抗氧化酶，在清除自由基保护组织、器官中发挥重要作用[14]，IL－1β 和 TNF－α 作为单核巨噬细胞产生的炎症因子，与机体炎症反应水平密切相关，是反映机体炎症程度的指标[15]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组、生理盐水组和H2S干预组大鼠血清和肾脏组织中MDA、IL－1β和TNF－α水平均升高，而SOD水平降低，说明脓毒症AKI大鼠机体和肾脏组织中发生了氧化应激、炎症反应，同时，结果显示，与模型组和生理盐水组相比，H2S干预组大鼠血清和肾脏组织中MDA、IL－1β和TNF－α水平均降低，而SOD水平升高，说明在给予H2S干预后，脓毒症AKI大鼠机体和肾脏组织中氧化应激、炎症反应水平降低，提示H2S可能通过抑制氧化应激和炎症反应而发挥肾脏保护作用。

本结果显示，与假手术组相比，模型组、生理盐水组和H2S干预组细胞凋亡率均升高，与模型组和生理盐水组相比，H2S干预组细胞凋亡率降低，说明外源性给予H2S干预后，可有效减少脓毒症AKI大鼠肾组织中上皮细胞凋亡。Bcl－2和Bax是Bcl－2家族重要成员，Bcl－2在抑制细胞凋亡中发挥重要作用，而Bax则可促进细胞凋亡，Bcl－2/Bax平衡失调后，可导致一系列的级联反应而最终导致执行细胞凋亡的Caspase－3分子激活，启动凋亡程序而诱导细胞发生凋亡[16]，本研究显示，脓毒症AKI大鼠肾脏组织中抗凋亡蛋白Bcl－2表达下调，而促凋亡蛋白Bax表达上调，从而激活Caspase－3使细胞发生凋亡，而外源性给予H2S干预后，这一过程被逆转，从而减少肾小管上皮细胞凋亡发生。

综上所述，H2S可有效改善脓毒症AKI大鼠肾功能，发挥肾脏保护作用，其机制可能与减轻氧化应激、炎症反应，抑制凋亡相关基因活化，从而减少肾脏组织中细胞凋亡有关。

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