尾加压素I I受体拮抗剂对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺组织TGF-β1表达的影响

张松跃，任跃，何跃娥，李皓，吴蓉洲

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童心脏中心 温州医科大学心脏发育与转化医学研究所，浙江 温州 325027）

高肺血流所致肺动脉高压（pulmonary arterialhypertension，PAH）是未经治疗左向右分流型先天性心脏病患者的严重合并症，最终会导致艾森门格综合征，直接影响其手术时机、成功率及术后的长期生存质量。既往研究表明，尾加压素 II（urotensin II，U II）在PAH的形成中起重要作用，但UII在PAH中的具体作用机制目前尚不明确[1-3]。本研究采用外科手术建立分流术模型，以模拟左向右分流型先天性心脏病所致PAH，应用U II受体拮抗剂帕洛舒仑（Palosuran）[4]，研究U II在PAH模型中的表达及其对转化生长因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）表达的影响，以探讨高肺血流性PAH的病理生理过程及可能存在的机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

1.1.1 主要试剂：帕洛舒仑、DMEM高糖培养基、FBS（胎牛血清）均购自美国Hyclone公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG均购自美国Abcam公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、甘氨酸及Tris均购自上海国药集团化学试剂有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；β-tubulin抗体、Tween20均购自美国Sigma-Aldrich公司；蛋白marker购自美国Thermo公司；抗U II多克隆抗体购自武汉博士德生物公司；DEPC购自上海生工生物工程有限公司；Dream Taq TM Green PCR Master Mix购自美国Thermo Fisher公司；Redzol、引物合成试剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司；U II标准品购自美国Sigma公司。

1.1.2 主要仪器：细胞培养超净台（苏州苏净集团安泰公司），高速冷冻离心机（日本日立公司），蛋白电泳转移系统（美国Bio-Rad公司），反转录仪（美国Thermo Fisher公司），PCR仪（美国Thermo Fisher公司），凝胶成像分析仪（法国Vilber Lourmat公司），荧光显微镜测定仪（德国莱卡公司），倒置相差显微镜（日本尼康公司），激光共聚焦扫描显微镜（德国卡尔蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 高肺血流型PAH模型建立及分组：选取60只体质量100～120 g的雄性SD大鼠[购自上海斯莱克公司，动物许可证号：SCXX（沪）2007-0005]。按随机数字表法分为3组，每组20只，分别为PAH组（S组）、假手术组（C组）及U II抑制组（M组）。S组和M组参照文献[5]进行造模：颈部正中切口，逐层分离，游离右侧颈总动脉和颈外静脉，4-0缝线结扎大鼠颈总动脉远心端，确认后，再取血管钳阻断其近心端，于远心端结扎线以下0.5 cm处切断颈总动脉，使颈总动脉固定于自制套管上，再将缝扎的动脉端插入颈外静脉上，观察发现静脉充血，或见明显静脉搏动，表明血管通畅，造模成功。C组仅游离颈总动脉、颈外静脉。M组大鼠造模后1周给予U II受体抑制剂帕洛舒仑灌胃，每次300 mg·kg-1，每日2次。其余组予等剂量0.9%氯化钠溶液每日2次做对照。

1.2.2 右心室压力测定：分别于造模后第4、第8、第12周，按随机数字表法每组选取5只大鼠，采用45 mg·kg-1苯巴比妥钠腹腔注射麻醉后，采用右 心导管导引插管分别检测右心室压力（相当于肺动脉压力）[6]，12周颈椎脱臼法处死后再留取心脏及肺组织标本。

1.2.3 Western blot法检测肺组织中U II和TGF-β1蛋白的表达：冻存的肺组织细胞加5倍体积细胞裂解液后于超声匀浆仪匀浆至无细胞结构，离心分装，用SDS煮沸变性后上样于聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，然后电转移至硝酸纤维膜上，与非放射性物质标记的抗体特异性结合成像以检测相关抗原的质与量，采用Quantity One凝胶软件分析系统来分析上述蛋白光密度值。

1.2.4 RT-PCR检测肺组织中TGF-β1 mRNA表达：取左下肺组织200 mg在液氮中研磨，一步法提取总RNA，后加入提前设计好的引物于PCR仪上进行RT扩增，扩增后产物mRNA再进行琼脂糖凝胶电泳，与Marker比较检测mRNA的含量，以β-tubulin为内参照。引物设计：检索Genbank数据库中β-tubulin、TGF-β1的mRNA序列，利用primer 5.0软件设计引物，然后经过Blast匹对，由上海赛百盛基因技术工程有限公司合成。β-tubulin上游引物5’-TACAATGGCTCCTCCGAT CT-3’，下游引物5’-AGATCAACCAGGACGGCA-3’，产物长度96 bp；TGF-β1上游引物5’-CAAGCAGAACCCAGTCTAT GC-3’，下游引物5’-TGAGGGACTCTGGTCTTTGTG-3’，产物长度432 bp。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性检验采用Levene检验，两两比较方差齐性者采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnett’sT3检验，U II及TGF-β1蛋白表达与肺动脉压力值的相关性采用Pearson相关性分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠生存情况及右心室压力比较 S组术后死亡4只大鼠（死于右心衰竭），M组术后死亡3只大鼠（死于右心衰竭），C组术后死亡1只大鼠（死因不明），死亡时间多在术后2～3周。造模后第4、第8、第12周，S组大鼠右心室压力均显著高于C组，M组显著低于S组，M组显著高于C组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3组大鼠右心室压力值随时间变化情况（n=5±s，mmHg）

表1 3组大鼠右心室压力值随时间变化情况（n=5±s，mmHg）

与C组比：aP＜0.05；与S组比：bP＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

组别 第4周 第8周 第12周C组 18.5±0.43 17.9±0.35 19.0±0.37 S组 25.3±1.53a 31.2±1.46a 37.4±1.32a M组 23.4±1.08ab 28.3±0.94ab 33.6±1.14ab

2.2 3组大鼠肺组织UI I和TGF-β1蛋白表达量比较 造模后第12周，S组大鼠肺组织中U II蛋白表达量较C组显著升高，M组较S组显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。S组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达量较C组显著升高，M组较S组显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 3组大鼠肺组织中TGF-β1 mRNA表达量比较 造模后第12周，S组大鼠肺组织中TGF-β1 mRNA表达量较C组显著升高，M组较S组显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.4 相关性分析 U II蛋白表达量与肺动脉压力值、TGF-β1蛋白表达量及mRNA表达量均呈正相关（r=0.987、0.979、0.966，P＜0.05）。见图4。

3 讨论

图1 3组大鼠U II蛋白表达量比较（n=5）

图2 3组大鼠TGF-β1蛋白表达量比较（n=5）

高肺血流性PAH是左向右分流型先天性心脏病最常见的并发症，对疾病发展和预后有决定作用。以往以PAH发生机制为中心，人们已经对多种体液、神经及局部因素于PAH的形成过程当中重建肺血管架构和舒缩功能效果进行了研究，但PAH病理过程十分复杂，至今尚未彻底阐明其发病机制[7-9]。

图3 3组大鼠肺组织中TGF-β1 mRNA表达量比较（n=5）

U II是目前发现收缩血管活性最强的活性肽[10]。我们的前期研究中也发现，在先天性心脏病PAH患儿的肺组织中存在着U II的表达，并随着肺动脉压力的升高表达明显增强[3]。PAH是指肺动脉平均压＞30 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）者，本研究中使用外科手术建立分流模型[5]，以模拟左向右分流型先天性心脏病所致PAH。大鼠于造模后监测右心室压力，至第12周，S组和M组大鼠右心室压力均＞30 mmHg，提示PAH，表明模型建立成功。本研究发现相对于C组，S组中存在U II蛋白含量显著升高，而在给予U II受体拮抗剂帕罗舒仑后，肺动脉压力显著降低，且经相关性分析，发现U II蛋白表达与肺动脉压力呈正相关关系，因而我们推测，U II在高肺血流性PAH大鼠模型中表达增高，可能参与了PAH的发生发展。

研究表明，肺血管重构是PAH发生发展的重要环节。平滑肌细胞、成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积是肺血管重构的基础[11-12]。而TGF-β是促进成纤维细胞表型转化和胶原合成的重要活性因子。其中TGF-β1是目前研究较多的细胞因子，活性最强，广泛表达于内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞等，参与调控细胞增殖、分化和ECM沉积。WANG等[13]报道，暴露在烟雾中的仓鼠发生PAH和肺血管重构过程中，TGF-β1蛋白显著升高。利用TGF-β1抑制剂SD-208可明显降低野百合碱诱导的大鼠PAH模型中肺动脉压力和血管重构程度[14]。DAI等[15]在体外培养的心肌成纤维细胞中发现，TGF-β1抗体能抑制U II的促胶原合成作用，且U II能够促进TGF-β1及其mRNA的表达，这表明U II可能通过TGF-β1发挥促心肌纤维化的作用。

图4 大鼠肺组织中U II蛋白表达量与肺动脉压力、TGF-β1蛋白表达量及mRNA表达量的相关性（n=10）

研究发现，PAH组大鼠肺组织中U II、TGF-β1蛋白及mRNA表达水平相对于假手术组有显著升高，相关性分析显示U II与TGF-β1蛋白和mRNA表达水平呈正相关，提示在高肺血流性PAH大鼠模型中，存在TGF-β1表达，U II能够促进TGF-β1浓度增加，而在给予U II受体拮抗剂帕罗舒仑后，大鼠肺组织中U II、TGF-β1蛋白及mRNA表达水平显著降低。推测其机制可能是帕罗舒仑抑制U II与其受体结合，使U II及TGF-β1表达水平降低，减轻血管收缩，抑制血管重构，从而缓解PAH的产生。

综上所述，在PAH大鼠模型中存在U II高表达，给予U II受体拮抗剂帕罗舒仑可显著抑制U II的表达，其机制可能是通过减少TGF-β1表达，而缓解大鼠高血 流性PAH形成和血管重建，但有待进一步研究阐明。

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