YAP1基因敲除对胰腺癌L3.6细胞增殖及迁移能力的影响

陈千杰，张金三，郭强，董晶莱，郭丽莎，李校堃

（温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035）

胰腺癌是恶性肿瘤，患者5年生存率不足5%[1]。 其增殖、侵袭能力极强，往往在发病早期即发生转移，是治疗的难点[2-4]。Yes-关联蛋白1（Yesassociate protein 1，YAP1）作为Hippo通路的关键转录辅助因子在胰腺癌的发生发展中有重要作用[5]，但相关机制仍不明了。YAP1具有调控细胞存活和增殖作用，参与癌细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）[6]。EMT是肿瘤转移的关键环节[7-8]。YAP1通过与转录因子结合参与胚胎发育进程[7，9-12]，在胚胎发育中起重要作用的因子，在癌变过程中往往被激活[13-14]。 当抑制KRAS后，会上调YAP1的表达，使YAP1直接参与肿瘤的形成[15-17]。本研究构建敲除YAP1基因的L3.6细胞，检测YAP1对L3.6细胞的增殖及迁移能力的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞株L3.6购自美国模式培养物集存库；pSpCas9（BB）-2A-Puro V2载体购自美国Addgene公司；DMEM培养液、胰蛋白酶、1%青链霉素、胎牛血清购于美国Gibco公司；RNA提取试剂购于美国Invitrogen公司；EndoFectinTMMax转染试剂购自广州复能基因有限公司；考马斯亮蓝购自上海碧云天生物公司；YAP（D8H1X）XP Rabbit抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，GAPDH 单克隆抗体购自英国Abcam公司；Western blot相关试剂、羊抗小鼠IgG二抗与羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物科技有限公司；正置、倒置荧光显微镜购自日本尼康公司；PCR仪、电泳仪、电泳槽、化学发光成像仪购自美国Bio-Rad公司，BD Accuri C6流式细胞仪购自美国BD公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；酶联免疫检测仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：L3.6细胞在含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中培养，常规置于37℃、5% CO2环境下生长。细胞融合至80%左右时常规传代。

1.2.2YAP1敲除载体的构建：采用CRISPR-Cas9技术在L3.6细胞中敲除YAP1基因。首先针对YAP1基因的第1个外显子序列，筛选出最佳的先导序列：5’-CATCAGATCGTGCACGTCCG-3’，并据此设计合成用于pSpCas9-KOYAP1构建的寡聚核苷酸序列：oligo1： 5’-CACCGCATCAGATCGTGCACGTCCG-3’，oligo2：5’-AAA CCGGACGTGCACGATCTGATGC-3’。经磷酸化修饰，并退火成双链后，连接克隆到BbsI酶切和去磷酸化修饰的pSpCas9（BB）-2A-Puro V2载体。转化到感受态的大肠杆菌DH5α后，挑单克隆提取质粒和测序分析，验证得到正确克隆的质粒。

1.2.3 筛选YAP1敲除的L3.6稳定细胞株：用CRISPRCas9-YAP1质粒转染L3.6细胞24h后，经过嘌呤霉素筛选48h，再采用有限稀释法，将单细胞悬液按50、100和200个细胞/皿的密度接种于10 cm培养皿，培养14 d，让肿瘤细胞生长成单克隆团，然后用克隆环定点消化各个克隆并接种至24孔板中，细胞生长至布满24孔板底75%时收集细胞，扩大培养以后，裂解获得细胞蛋白，应用Western blot法检测L3.6细胞的YAP1蛋白表达以验证YAP1敲除是否成功。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：分别收集WT组细胞（L3.6野生型细胞）和YAP1-KO组细胞（已敲除内源YAP1基因的L3.6细胞），细胞裂解液4℃裂解，12 000r/min离心，提取各组细胞总蛋白，用Bradford法测量蛋白浓度。变性后的蛋白样本进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，用孔径0.45 μm的PVDF膜进行转膜，封闭后用YAP1（1:1 000）、GAPDH（1:5 000）抗体杂交。TBST洗膜3次/7min，再加入相应的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（鼠）二抗（1:10 000）室温摇床孵育1h，TBST洗3次后，ECL化学发光法显影，凝胶成像系统曝光并分析结果。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖情况：分别取对数生长期的WT组及YAP1-KO组细胞，铺到60 mm培养皿中，待细胞汇合到70%～80%后，胰酶消化，用培养基重悬细胞并计数，将稀释好的细胞悬液以每孔2×103个细胞接种于96孔板，每组细胞做6个复孔。放置于37℃、5% CO2培养箱中分别培养1、2、3、4、5、6 d后，每孔加入10μL MTT溶液（5 mg/mL），在培养箱中继续培养4h后，吸弃上清，加入150μL DMSO溶液，于490 nm波长时测各孔吸光度值并记录结果。重复实验3次，取均值。

1.2.6 EdU细胞标记和流式细胞仪检测细胞周期：分别提前1 d将WT组及YAP1-KO组细胞以1×105个/mL浓度接种于培养皿中，以调整为细胞最优状态，待细胞融合度达70%～80%时，用不含EDTA的胰蛋白酶消化分装（操作过程要轻柔），离心，4%多聚甲醛固定20min后，2 mg/mL甘氨酸中和5min，0.5% Triton X-100渗透后，加500μL的1×Apollo®染色反应液，重悬细胞，避光室温孵育10min后，1 500r/min 离心5min，弃染色反应液。0.5% Triton X-100渗透剂室温清洗1～3次，PBS重悬，置于流式细胞仪中检测，观察增殖细胞的染色情况。

1.2.7 细胞划痕实验检测细胞迁移能力：提前用马克笔在6孔板背后，每孔均匀画3条等距离横线，然后每孔铺约7×105个细胞，待次日观察细胞已长满皿底，用10μL小枪头比着直尺垂直于背后的横线划痕。PBS洗细胞3次，去除脱了漂浮的细胞，加入无血清培养基，放入37℃、5% CO2细胞培养箱。按第1、第2、第3天的同一时间点取出6孔板，置于显微镜下观察同一位置细胞迁移变化，最后拍照记录。重复本实验3次，取均值。

1.2.8 Transwell实验检测细胞迁移能力：首先消化并收集各组细胞，离心，用无血清培养基重悬并计数，以200μL共1×105个/孔的细胞密度铺至小室的上室。下室内加入500μL含20%胎牛血清的完全培养基，置于37℃、5% CO2细胞培养箱24h。培养结束后取出小室，用棉签小心擦去微孔膜上层未穿过膜的细胞，将小室用PBS浸泡清洗3次/5min， 4%多聚甲醛固定35min，0.1%结晶紫对微孔膜下细胞染色25min，再用PBS浸泡清洗3次/5min，至膜上背景紫色基本消失，用倒置显微镜观察微孔膜。每组设定3个复孔实验，取均值。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS18.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，2组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRISPR-Cas9载体及YAP1敲除细胞株构建 如图1所示，构建的pSpCas9-KOYAP1质粒经测序分析表明插入的序列及位点正确，目的基因YAP1的敲除载 体质粒构建成功。为获得YAP1敲除的稳定细胞系，用上述CRISPR-Cas9质粒转染人胰腺癌细胞系L3.6，筛选后产生的单克隆团（见图2A），分离培养后，获稳定细胞株。经Western blot验证，相对于WT组，YAP1-KO组细胞中的YAP1蛋白表达完全缺失，说明成功获得了YAP1敲除的L3.6稳定细胞株（见图2B）。

2.2 检测敲除YAP1前后细胞增殖能力的变化 为检测YAP1基因敲除对细胞增殖的影响，采用MTT实验构建细胞生长曲线。结果发现，相对于野生型的WT组细胞，YAP1-KO组细胞的增殖速度明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3A。进一步采用EdU细胞增殖实验结合流式细胞仪观察细胞周期分布，发现YAP1-KO组及WT组细胞的EdU阳性率，即处于S期的细胞数所占各自总细胞数的比例，分别为37.4%和54.7%，见图3B。此结果表明Cas9敲除YAP1基因表达显著抑制胰腺癌细胞L3.6的增殖能力。

图1 用于YAP1基因敲除的质粒测序图谱（下划线为设计插入的先导序列）

图2 YAP1基因敲除细胞株的构建

2.3 YAP1对胰腺癌细胞体外迁移能力的影响 为了观察YAP1基因敲除对胰腺癌L3.6体外迁移的影响，采用划痕实验来比较细胞的迁移能力。结果发现，WT组在第1、第2、第3天的划痕闭合进程日渐明显，而YAP1-KO组划痕几乎没有闭合，表明WT组细胞的迁移速度随着时间的推进而增加，在第3天达到最大值，但是YAP1-KO组的迁移速度明显下降，几乎丧失迁移能力。2组细胞各时间段对应的迁移情况差异明显（见图4A）。进一步的Transwell实验发现，在所有观察的时间点，YAP1-KO组细胞转移、穿透到下室的细胞数量与WT组比较均显著降低（见图4B）。

图3 比较YAP1敲除前后L3.6细胞的增殖情况

3 讨论

YAP1作为Hippo通路下游的主要效应蛋白之一，在肿瘤发生发展中的作用逐渐被认知。绝大部分的胰腺癌中存在KRAS突变，但研究发现抑制KRAS后，复发的胰腺癌中存在YAP1的过度激活，并且使胰腺癌细胞的侵袭转移能力增强[16-17]。这提示过表达YAP1在胰腺癌复发、恶性化的过程中起重要作用，但是其机制仍不明确。尽管人们已经认识到YAP1参与部分肿瘤细胞增殖及转移的进程，但是对胰腺癌细胞YAP1缺失后的增殖及转移能力的具体变化还鲜有涉及。因此本研究利用CRISPR-Cas9技术构建YAP1敲除的稳定胰腺癌细胞系，通过一系列细胞生物学实验，检测敲除YAP1后对胰腺癌细胞增殖和转移能力的影响。

图4 YAP1敲除对L3.6细胞迁移能力的影响（×10）

CRISPR-Cas9技术是当下热门的基因编辑技术。该技术可以方便、快捷地编辑细胞的基因组，在DNA水平调控目的蛋白的表达、突变[18-19]。在本研究 中，我们设计了针对YAP1的寡聚核苷酸的先导序列，基于pSpCas9（BB）-2A-Puro的载体，构建了CRISPRCas9-YAP1质粒。转染L3.6细胞后，经过抗性筛选和单克隆化以后，成功获得了敲除YAP1基因的L3.6细胞，标记为YAP1-KO细胞株。经验证，其YAP1蛋白已经被完全敲除，且经多次传代后，细胞性状仍保持稳定，能进行下一步的增殖、迁移等生物学功能实验。

细胞的恶性增殖与转移在肿瘤的初发-恶性化过程中起着关键作用[20-21]，由于癌细胞增殖速度快，从肿瘤原发灶侵袭近端的正常组织并发生迁移到远端脏器，甚至扩散到全身，因此癌细胞的增殖和迁移能力在肿瘤研究过程中至关重要[22-23]。本课题利用经Cas9技术敲除胰腺癌细胞中YAP1基因的模型，研究YAP1缺失对胰腺癌细胞增殖及迁移能力的影响，为此后进一步解析YAP1在胰腺癌发生发展中的作用及机制研究奠定基础，结果表明YAP1缺失后，能显著抑制胰腺癌L3.6细胞的增殖和迁移能力。EdU是胸腺嘧啶类似物，能在细胞增殖中代替胸腺嘧啶，嵌入复制中的DNA分子内，通过EdU与荧光染料的特异性结合，探测荧光信号，从而检测细胞中DNA的复制活性，计算新增殖的细胞数量。MTT可以被细胞增殖过程中线粒体内的一些脱氢酶还原生成深紫色产物，当细胞增殖数越多，则在570 nm波长吸光度越高，因而被广泛用于监测细胞增殖变化。本研究发现YAP1-KO组L3.6细胞的EdU阳性增殖率（即处于S期的细胞比例）和MTT吸光度（即细胞的相对活性）明显低于WT组的L3.6细胞，表明敲除YAP1后，细胞周期受到阻滞，DNA复制活性、线粒体活性降低，表明YAP1敲除的胰腺癌细胞的增殖能力受到抑制。细胞划痕法可以测定细胞的迁移能力，其借鉴体外细胞致伤愈合模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后比较各组细胞间的迁移能力。Transwell是在上室接种细胞，下室加入FBS或特定趋化因子如FGF，细胞可能会穿透过聚碳酸酯膜向营养成分高的下室转移，对下室的细胞染色，可直观反映细胞的迁移情况。本研究结果显示YAP1缺失的胰腺癌细胞，其划痕愈合和穿透过膜等迁移能力受到极大地抑制。

综上所述，在胰腺癌L3.6细胞敲除内源YAP1后，其增殖和转移能力明显减弱，这揭示YAP1有望成为治疗胰腺癌的新靶标。

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