UPLC测定彝药满山香中芦丁含量△

郝庆秀，康利平，朱寿东，金艳，郭兰萍

(中国中医科学院 中药资源中心/道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700)

彝药满山香来源于木兰科植物合蕊五味子的干燥藤茎和根，具有舒筋活血、消肿止痛的功能，用于治疗骨折、慢性胃肠炎、风湿性关节炎、痛经、外伤出血等。以满山香为主要原料的灯银脑通胶囊用于中风中经络、瘀血阻络的治疗。目前，野生满山香植物资源种群稀少，蕴藏量小[1]；在地方标准中，以根茎入药，并且没有质量控制的指标成分[2]。在实际应用中，制药厂以收购药农采集的野生满山香植物根茎为原料药，砍伐后的叶片资源没有被有效利用。目前，文献报道中关注的是满山香根茎中的木脂素类成分[3-6]。本课题组前期研究结果提示，彝药满山香富含芦丁成分[7]。芦丁被称为Vitamin P，具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、降低血压、保持血管弹性、神经保护作用，能预防或治疗糖尿病相关疾病[8-10]。目前未见对满山香中芦丁成分定量研究的报道。本实验利用UPLC技术对满山香根茎和叶片中的芦丁含量进行测定，以期为彝药满山香资源的开发利用提供科学依据；同时，为扩大芦丁的天然来源提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

满山香样品采集于云南、贵州，共13批，经中国中医科学院金艳助理研究员鉴定为木兰科植物合蕊五味子Schisandrapropinqua(Wall.)Baill.，原植物标本保存于中国中医科学院中药资源中心，样品信息见表1。

表1 满山香样品信息

芦丁对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号：12040302，纯度≥98.0%)。色谱级乙腈、甲醇、甲酸(Merck公司，德国)；超纯水为Milli-Q纯水系统制备(电阻≥18.2 MΩ，Millipore 公司，美国)。

1.2 仪器

UPLC-H-CLASS，全波长紫外检测器(PDA)(Waters公司，美国)，色谱柱为 Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司，美国)，分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，离心机(Eppendorf公司，德国)，KQ-100DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，0.2 μm注射器式滤器(Pall公司，美国)。

2 方法与结果

2.1 样品溶液及对照品溶液制备

样品经干燥、粉碎，过40目筛，准确称取样品粉末0.3 g，加70%甲醇水溶液(V/V)15 mL，超声提取30 min，12 000 g离心10 min，取上清液经0.2 μm滤膜过滤，重复提取1次，合并滤液，作为供试品溶液。准确称取对照品适量，用70%甲醇水溶解，定容 10 mL，备用。

2.2 实验条件

2.2.1色谱条件 流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，按程序梯度洗脱(5∶95→95∶5，13 min)，柱温：40 ℃，流速：500 μL·min-1，进样量：1.0 μL。Acquity UPLC PDA 检测器，波长范围：190～400 nm。通过优化色谱条件，发现芦丁在365 nm处干扰少，吸光度强，选择365 nm进行检测分析。芦丁对照品和满山香样品提取物的UPLC-PDA色谱分析结果见图1。

注：A芦丁对照品；B根茎提取物；C叶片提取物。图1 满山香提取物的UPLC-PDA图

2.2.2定量下限考察 通过考察不同浓度和不同进样量的对照品溶液，结果发现芦丁的检测下限为0.328 μg·mL-1，定量下限为1.64 μg·mL-1。

2.2.3 线性关系考察 精密称取2.10 mg 芦丁对照品，置10 mL量瓶中，加70%甲醇水至刻度摇匀，制成对照品溶液Ⅰ(210 μg·mL-1)，吸取对照品溶液Ⅰ 5.0 mL稀释定容到10 mL量瓶中，制成对照品溶液Ⅱ(105 μg·mL-1)，依次稀释配成对照品溶液Ⅲ(52.5 μg·mL-1)、对照品溶液Ⅳ(26.25 μg·mL-1)、对照品溶液Ⅴ(13.125 μg·mL-1)、对照品溶液Ⅵ(6.562 5 μg·mL-1)、对照品溶液Ⅶ(3.281 25 μg·mL-1)、对照品溶液Ⅷ(1.640 25 μg·mL-1)，进样1.0 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分为纵坐标，芦丁的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果芦丁在1.64～210 μg·mL-1具有良好的线性关系，计算得回归方程：Y=340.3X-1 386.8，r=0.999 8。

2.2.4 精密度试验 取同一对照品溶液，在所确定的HPLC条件下，连续进样6次，分别记录其峰面积，计算芦丁峰面积的RSD=0.69%。

2.2.5 稳定性试验 准确称取同一样品粉末6份，按2.1制成供试品溶液，在所确定的UPLC条件下，分别于配制后0、1、3、5、8、12、16、20 h，测定芦丁峰面积，RSD=1.03%，表明样品至少在20 h内稳定。

2.2.6 重复性试验 准确称取同一样品粉末6份，按2.1制成供试品溶液，在所确定的HPLC条件下测定峰面积，RSD=1.58%。

2.2.7 加样回收率试验 准确称取同一粉末样品6份(1号根茎样品)，分别添加两份16.8 μg芦丁对照品，两份21.0 μg芦丁对照品，两份25.2 μg芦丁对照品，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，进样量1.0 μL，计算回收率，结果见表2。

表2 满山香药材中芦丁加样回收率试验

2.3 样品含量测定

分别准确称取各个满山香样品粉末0.3 g，按2.1制成供试品溶液，在所确定的UPLC条件下测定，结果见表3。

表3 满山香药材中芦丁含量检测结果

3 讨论

在本实验选定的条件下，对彝药满山香药材中芦丁含量进行了定量测定，经方法学考察，方法准确可靠、简便快速。从检测结果看，不同产地满山香的根茎中芦丁质量分数在30～187 μg·g-1，差异明显。本研究所用根茎样品的直径从0.1 cm到4 cm不等，其中1号根茎样品直径最大，而芦丁含量最低，据当地药农估计，1号根茎的生长年限有40年左右，其他根茎的生长年限大约为2、3、5、10年不等。由于野生药材的生长年限不易准确断定，只能粗略地认为药材直径与藤茎的生长年限呈正相关关系。从本实验结果看，芦丁成分的含量与药材的年限呈负相关关系。年限和产地差异对药材的影响有待进一步研究。

不同产地满山香的叶片中芦丁含量在4.2～13.6 mg·g-1。叶片中芦丁的含量均比较高，并且比对应的根茎药材中高出数十倍、甚至数百倍，某些地区满山香叶片中芦丁含量达1.36%。满山香叶片有开发利用价值，建议开展满山香叶片的应用研究，避免根茎药材采集时废弃大量的叶片而造成自然资源的浪费。本研究为彝药满山香资源的开发利用奠定了基础，同时为扩大芦丁的天然来源提供了参考。

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