煤矸石堆对土壤微生物活性的影响研究

袁 敏，张启来，霍永青

(1.天津市环境保护科学研究院，天津 300191；2.天津市武清区环境保护监测站，天津 301700；3.天津市联合环保工程设计有限公司，天津 300191)

0 引 言

随着世界人口的持续增加和经济发展，某些地区生态环境正在不断恶化，在这种形势下，土壤质量受到人们的普遍关注[1]。目前，我国现有煤矸石山1 500多座，侵占土地约1.5×104km2，造成土地资源的浪费，煤矸石是我国产出量最大的工业固体废弃物之一[2-3]。煤矿中含有的多种非中性物质以及微量重金属等，通过淋溶、扬尘等方式进入土壤，再通过径流、渗透等方式在土壤中扩散，造成一定区域内土壤酸、碱性的明显改变，打破了土壤中重金属的本底值和平衡关系，破坏植被适宜生长的环境，造成大量植物枯死，短期内很难恢复[4-6]。为了消除污染，自20世纪60年代起，国内外很多学者就煤矸石的污染问题展开了相关研究工作，探索煤矸石处理和利用的新方法[7-13]。

单家村煤矿是山东裕隆矿业集团有限公司的发源地和经济支柱企业，位于山东省曲阜市时庄镇境内，矿井南临327国道1 km，东距曲阜市14 km，井田面积6.3 km2，煤质为低灰、低磷、特低硫2号气煤。单家村煤矿自二十世纪七八十年代开始建设以来，煤矸石山堆积超过30年。煤矸石除含有粉尘、SiO2、A12O3、Fe、Mn等常量元素外，还有其他微量重金属元素，如Pb、Sn、As、Cr等，这些元素为有毒重金属元素。当露天堆放的煤矸石山经雨水淋蚀后，产生酸性水，污染周围的土地和水体(因当时考虑的是监测周边土壤污染状况，所以煤矸石具体成分含量没有分析)。

土壤微生物活性能够简单快速的鉴别出土壤质量的好坏，而土壤中重金属含量对土壤微生物影响较大[14]。重金属的污染均能降低细菌、真菌等的数量，能够改变土壤微生物的新陈代谢[15-18]。重金属污染在一定程度上也影响土壤生态系统氮循环[19]。有学者研究表明六价铬污染对不同的土壤生化作用有不同的效应[20]。研究土壤微生物活性与重金属含量的关系对于揭示地区土壤污染状况和修复土壤重金属污染具有重要意义。

本试验从微生物活性角度入手，分析煤矸石堆造成土壤重金属污染的生物机制。实验采用原子吸收分光光度法测定距离矸石堆不同距离中土壤重金属(Cr6+、Pb、Hg等)的含量，确定土壤污染程度；通过微生物培养确定周围土壤中三种常见微生物(细菌、放线菌和霉菌)的活性，探讨煤矸石堆对周围土壤中微生物活性产生的影响。

1 材料与方法

1.1 土壤样品的采集

土样采自曲阜市单家村裕隆煤矿煤矸石堆附近，以煤矸石堆为中心，分别在距矸石堆0 m、10 m、50 m、80 m、125 m的圆周上采样(图1)。每个圆周均设10个采样点，采样深度为土壤表层0～20 cm。取回土样，将同距离、不同方位采样点处的样品混合，将土块压碎，除去石块、植物残根等杂物，将土壤铺成薄层，在阴凉处自然风干。风干后的土样用陶瓷研碎后，过筛(筛孔直径2 mm)，除去2 mm以上的砂砾和植物残根，用四分法反复多次弃去多余样品，用玛瑙研钵继续研细，然后过-0.025 mm筛，充分混匀后备用[21]。

1.2 实验方法

1.2.1 重金属含量的测定

土壤样品采用硝酸-盐酸-高氯酸分解体系法分解。称取0.5 g(准确到0.1 mg)风干土样于50 mL烧杯中，再用少量去离子水湿润，加硝基盐酸5 mL，加热保持微沸至有机物剧烈反应后，加高氯酸1 mL继续加热至样品分解呈灰白色，再用0.12 mol/L的硝酸溶解。待溶液冷却后用50 mL容量瓶定容，再过滤一两次，得澄清透明溶液，转移至聚乙烯塑料瓶中保存待测。

取适量土壤消解液，用原子吸收分光光度计测量其中的重金属(Cr6+、Pb、Hg等)含量[22]，与土壤背景值对照。

1.2.2 土壤微生物(细菌、放线菌、霉菌)的培养

土壤微生物(细菌、放线菌、霉菌)的培养与分离见表1[23]。

图1 采样点分布

样品来源分离对象分离方法稀释度培养基培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-6牛肉膏蛋白胨30～371～2土样放线菌稀释分离10-3高氏一号285～7土样霉菌稀释分离10-3马丁氏28～303～5

2 结果与分析

2.1 土壤样品理化性质

根据土样的采集情况和相关文献，土壤样品的理化性质具体包括土壤的pH值、含水率、土壤有机质、阳离子交换量、重金属总量、重金属有效态等，具体见表2。

在研究重金属对土壤微生物生长代谢的过程中，对其起主要影响作用的是重金属的有效态形式，因此以重金属有效态为研究对象。

2.2 土壤重金属有效态量随距离变化分析

从图2可以看出，土壤中重金属汞的有效态含量随距离煤矸石山距离的增大先下降较为迅速，从50 m以后下降缓慢。w(Hg)的最高值达到1.08 mg/kg。用GB15618—1995中土壤二级环境质量标准值(Hg≤0.3 mg/kg)作为参照值，可发现前两个采样点土壤汞含量已超过此背景值，可见此处土壤已受到较严重的汞污染。可能与重金属汞在土壤中迁移能力或周围土壤环境及其种植的植物有关。

表2 供试土壤的理化性质

图2 土壤中重金属随距离变化

对于铅含量，总体来讲随距煤矸石山距离的增大呈下降趋势。但是在0～10 m内下降趋势明显，10 m后随距离增大铅含量基本维持在50 mg/kg左右。用GB15618—1995中土壤二级环境质量标准值(Pb≤ 250 mg/kg)作为参照值，可见此处土壤中铅含量并没有超过这一值，可能与煤矿开采较晚以及当地气候或土壤环境有关。

土壤中Cr6+含量随距离煤矸石山距离的增大呈下降趋势。距离煤矸石125 m处土壤中Cr6+含量与0 m处相比约减少了6.49倍。用GB15618—1995中土壤二级环境质量标准值(Cr6+≤0.3 mg/kg)作为参照值，可以发现前四个采样点土壤Cr6+含量已超过此背景值，可见此处土壤已受到较严重的Cr6+污染。土壤中Cr6+含量的分布是矿渣内细小颗粒物随风迁移的结果，在风向和风速一定的情况下，主要受距离矸石山远近的影响[24]：距离矸石山愈近，矿渣堆内的细小颗粒物在随风迁移时在此部位沉积的就愈多，而矿渣内细小颗粒物中Cr6+含量较高，Cr6+在此部位的富集就愈多，土壤中Cr6+含量也就增加的愈多；距离矸石山愈远，矿渣内的细小颗粒物沉积的就愈少，土壤中Cr6+含量的增加也就愈少。

2.3 土壤微生物含量分析

土壤中的菌类数量变化见图3。

2.4 重金属复合污染对细菌、放线菌、霉菌生长影响的相关回归分析

从图3菌类数量变化可以看出，各采样点处细菌菌落数均低于对照点，在其他影响因素不变的情况下，细菌对重金属的敏感性最强，对细菌的生长产生抑制作用，使得细菌不能正常生长[25-27]。由回归方程Y=12.5+0.165X1+0.621X2-0.085X3及方差分析表3可以看出，土壤重金属有效态含量对细菌数量的变化产生了显著影响，三种重金属中，Pb是影响细菌含量变化的主要因素，Pb含量每变化一个单位，细菌数量平均变化0.621个单位。并且，在重金属对细菌生长产生抑制作用的情况下，Pb与细菌数量基本呈现正相关关系(图4)，是由于采样点处土壤理化性质不符合细菌生长所需最适环境(如最适pH值为6.5～7.5)造成的。有研究表明：重金属Pb对土壤酶具有明显的抑制作用[26]。重金属破坏了土壤酶活性从而导致微生物生存环境恶劣，细菌数明显呈下降趋势。

图3 菌类数量变化图

变异来源平方和自由度均方F回归96.654332.21820.681∗∗剩余68.546441.558总和165.20047

注：F3，44，0.01=4.331，F> F3，44，0.01,差异极显著。

由回归方程Y=26.485+0.068X1-0.624X2-0.818X3和方差分析表4可以看出，土壤重金属有效态含量对放线菌数量的变化产生了显著影响，超过了1%的极显著水平，反映了土壤中重金属的积累，特别是Pb和Hg，对放线菌的负面制约作用。由图5放线菌受Pb和Hg影响曲线图(Hg的含量较低，为方便起见，作图时放大10倍)可看出，0 m由于“边际效应”，放线菌数与重金属有效态含量呈现正相关趋势；除0 m以外，其他采样点处Hg与放线菌变化呈现负相关关系。原因可能是微生物对不同金属毒性的敏感性差异，高浓度的重金属会导致微生物抗逆性增强，引起种群数量变化，从而降低微生物数量；低浓度的重金属可以促进土壤微生物的生长和繁殖，从而提高微生物数量，这与韩桂琪等[16]的研究结果相似。因此，重金属Hg是影响放线菌数量变化的主要重金属元素。

图4 细菌受铅含量变化图

变异来源平方和自由度均方F回归10.63833.5464.182∗∗剩余116.1621370.848总和126.800140

注：F3。137，0.01=3.011，F> F3，137，0.01，差异极显著。

图5 放线菌受Hg、Pb影响变化曲线图

由回归方程Y=17.905-0.099X1-6.55X2-2.456X3和方差分析表5可以看出，土壤重金属有效态含量对霉菌数量的变化产生了显著影响，显著性水平达99%以上。由图6霉菌受Hg和Pb影响曲线图(Hg的含量较低，为方便起见，作图时放大10倍)可以看出，Hg与霉菌变化呈明显负相关关系，是由于高浓度的重金属破坏了霉菌的生存环境，抑制了霉菌正常新城代谢，影响霉菌的正常生长；10 m之后Hg的浓度明显降低，霉菌数量显著增加，而后逐渐趋于稳定。原因可能是土壤环境在重金属的胁迫下，土壤微生物群体组成或结构发生了一定的变化，而低浓度的重金属对土壤环境影响较小，霉菌对重金属的耐性增强，其对霉菌的抑制作用减弱，使得霉菌数量相对有所增加，这与向彬等[26]的研究结果类似。因此，Hg为影响霉菌数量变化的主要重金属元素。

表5 重金属对霉菌影响的正交试验方差分析表

注：F3，69，0.01=4.099，F> F3，69，0.01，差异极显著。

图6 霉菌受Hg、Pb影响变化曲线图

3 结 论

1) 在煤矸石污染源的作用下，土壤中重金属Pb和Hg的含量全部超出《土壤环境质量标准》(GB15618—1995)中的一级标准，重金属Hg在0 m和10 m处的含量甚至超出二级标准的要求。其中，w(Pb)的最高值达到114.247 mg/kg，大大超过GB15618—1995中的一级标准(35 mg/kg)；w(Hg)的最高值达到1.08 mg/kg。

2) 铅在土壤中的含量在0 ～10 m处下降明显，但高于土壤二级环境质量标准值。随距离煤矸石山距离的增大，土壤中Cr6+含量急剧下降。土壤中的铅、铬进入土壤后主要和土壤中的碳酸盐、有机质和氧化物结合，受土壤pH值等影响。

3) 在煤矸石堆的影响下，土壤中重金属(Cr6+、Pb、Hg)对土壤微生物(细菌、放线菌、霉菌)产生影响。随着重金属含量的降低，土壤微生物受其影响程度减弱。由相关回归分析可见，在99%置信区间下计算所得的F值均大于临界值，说明这三种重金属对微生物的影响极显著。Pb对细菌的影响最为显著，而Cr6+和Hg对其影响较弱；放线菌同时受Pb和Hg两种重金属的影响，其中Hg对其影响最为显著；Hg、Pb较之Cr6+对霉菌的影响更为显著，而且Hg有效态含量与霉菌数量变化成明显负相关关系。

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