响应面法优化胡萝卜乳酸饮料的生产工艺及对DPPH的清除作用

刘治心，张婉滢，李湘利，刘静

（济宁学院生命科学与工程系，山东曲阜273155）

0 引言

乳酸饮料主要以牛奶、果蔬等为原料，利用乳酸发酵作用制备的富含活性乳酸菌及代谢物的饮料[1-2]，具有调节人体微生态平衡、延缓衰老、降低胆固醇和提高机体免疫力等功效[3]。含有功效成分的果蔬原料进行乳酸发酵可进一步提高营养价值，具有广阔市场前景[4]。现有研究表明[5]，自由基可引起癌症、动脉粥样硬化和老年痴呆等100余种疾病，是导致衰老的主要因素。具有自由基清除能力的天然抗氧化剂与合成抗氧化剂已成为相关领域的研究热点[6-7]。

胡萝卜（Daucus carota L.），又称红萝卜或甘荀，富含碳水化合物、蛋白质、脂肪等营养成分及β-胡萝卜素、钙、铁、锌等元素[8]，具有防癌抗癌、降压降脂、抗衰老、清除自由基、降低肿瘤发生率、增加免疫力等功效，是一种对人体健康极为有益的果蔬原料[9]。为开发乳酸饮料的适宜果蔬种类，制备一种具有较强DPPH自由基清除作用的果蔬饮料，本研究以胡萝卜、牛奶为主要原料，应用乳酸菌进行发酵，以期获得一种口味极佳、风味独特、具有较强抗氧化作用的新型胡萝卜乳酸饮料。

1 实验

1.1 材料与试剂

胡萝卜，牛奶，白砂糖，果胶酶（酶活性＞32 000 U/g），乳酸菌（保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1∶1），羧甲基纤维素钠（CMC）、黄原胶、海藻酸钠等，食品添加剂级；DPPH·，Sigm a分装；其他试剂，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JM-50胶体磨，TD 6低速离心机，DH 6000II恒温培养箱，SCBX-1000蔬菜保险柜，723PC可见分光光度计，FA 2004N电子天平，30-6 S高压均质机。

1.3 方法

1.3.1 胡萝卜乳酸饮料的制备

胡萝卜经清洗去污，沸水热烫4～6 m in，冷却后按一定料液比榨汁。用质量分数0.01%柠檬酸和质量分数0.1%的Vc（按胡萝卜质量计）护色，用0.04%的果胶酶在45℃酶解90 m in。在胡萝卜汁中加入牛奶、白砂糖和稳定剂，加热至50～60℃于15～20 M Pa均质，在90～95℃杀菌5 m in，冷却至45℃后接种乳酸菌发酵、0～4℃冷藏即得胡萝卜乳酸饮料[10]。

1.3.2 单因素实验

考察胡萝卜与水的比例（料液比）、加奶量、加糖量、接种量、发酵温度及发酵时间对胡萝卜乳酸饮料发酵酸度、感官评分和DPPH清除率的影响。乳酸发酵基本条件为料液比1∶3，加奶量15%，加糖量6%，接种量0.015%，发酵温度42℃，发酵时间8 h。其中，料水比设定为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5；加奶量设定为10.0%，12.5%，15.0%，17.5%，20.0%；加糖量设定为4%，5%，6%，7%，8%；接种量设定为0.005%，0.010%，0.015%，0.020%，0.025%；发酵温度设定为38，40，42，44，46℃；发酵时间设定为4，6，8，10，12 h。

1.3.3 响应面优化实验

在单因素实验基础上，选取加糖量（X1）、发酵温度（X2）、接种量（X3）、发酵时间（X4）四个对胡萝卜乳酸饮料影响较大的因素为自变量，以感官评分为响应值，根据Box-Behnken实验设计原理[11]，采用Design-Expert V 8.0.6软件对所得结果进行分析，获得最佳制备工艺条件。实验因素与水平如表1所示。

表1 响应面分析法的因素与水平

1.3.4 稳定性实验

以CM C（羧甲基纤维素）-黄原胶、CM C-海藻酸钠、黄原胶-海藻酸钠为稳定剂，稳定剂添加量为0.3%，于所得最佳条件下制备乳酸饮料，冷藏静置30 d后测定饮料稳定性[12]。

1.3.5酸度的测定

采用GB5413.34-2010测定，用吉尔涅尔度（°T）表示[13]。

1.3.6感官评价方法

由10人组成感官评定小组，对乳酸饮料颜色、香味、组织状态和口感进行评定[14]，标准如表2所示。

1.3.7 DPPH清除率的测定

参照李湘利等[15]的方法略调整。用无水乙醇配制浓度为0.2 mm o l/L的DPPH溶液，移取2 m L乳酸饮料（经3 000 r/m in离心10 m in得上清液）于10 m L试管中，加入DPPH溶液2m L，室温反应30m in，于517 nm测吸光值（A1），测定同体积饮料和无水乙醇混匀后的吸光值（A2）及无水乙醇和DPPH混匀后的吸光值

表2 胡萝卜乳酸饮料的感官评分标准

1.3.8 稳定性的测定

离心管洗净并称其质量（M1），取10 m L饮料于离心管中，在3 000 r/m in离心20 m in，弃去上清液后倒置10 m in，称取沉淀物和离心管的质量（M2），计算沉淀率[12]，即

1.3.9成品指标的测定

蛋白质测定采用凯氏定氮法，总糖测定采用直接滴定法，可溶性固形物测定采用手持折光仪法[16]；微生物指标测定参照文献[17]的方法。

1.3.10数据统计方法

采用软件IBM SPSS Statistics 22.0进行单因素结果分析，应用软件Design Expert 8.0.7建立数学模型和响应面分析。

2 结果与分析

2.1 料水比的确定

由表3可以看出，料水比为1∶3时，所得乳酸饮料的颜色、香味、组织状态及口感均较好，感官评分为87分，高于其他处理（P＜0.01）。因此，确定料水比1∶3进行单因素实验和响应面实验研究。

2.2 单因素实验结果

由图1可知，随加奶量（图1a）增加和发酵时间（图1e）延长，感官评分和DPPH清除率先增大后减小，酸度逐渐上升；随加糖量（图1b）增加，酸度略有下降，感官评分和DPPH清除率呈先升后降的趋势；随接种量（图1c）增大和发酵温度（图1d）升高，酸度、感官评分和DPPH清除率均呈先增大后减小的变化趋势。考虑到技术与经济因素，选择加奶量15%、加糖量6%、接种量0.010%、发酵温度42℃、发酵时间7 h为较优工艺参数，为突出胡萝卜乳酸饮料特性，固定加奶量15%进行响应面优化实验。

2.3 响应面优化实验结果

以X1（加糖量）、X2（发酵温度）、X3（接种量）、X4（发酵时间）为变量，以乳酸饮料感官评分为响应值，根据BoX-Behnken中心组合实验原理设计响应面实验，结果如表4所示。

表3 料水比对饮料感官品质的影响

图1 各单因素对酸度、感官评分及DPPH清除率的影响

表4 响应面分析方案及实验结果

2.3.1回归模型的建立与分析

利用软件Design-Expert 8.0.6对表4的结果进行回归分析，得到乳酸饮料感官评分（Y）与各因素之间的回归方程：Y=-989.48+12.84X1+43.18X2+4397.00X3+26.89X4+0.038X1X2-5.00X1X3+0.42X1X4-75.00X2X3-0.18X2X4-40.00X3X4-1.32X12-0.49X22-50933.33X32-1.57X42。

对所得实验模型进行方差分析，结果如表5所示。

表5 响应面回归模型方差分析

由表5可知，失拟项不显著（P=0.2652＞0.05），而模型极显著（P＜0.0001），模型确定系数R2=0.9100，调整确定系数R2Adj=0.8200，这表明实验模型能较好的反应各因素与响应值间的变化关系，可预测乳酸饮料的实际得分。方差分析还表明，X2，X12，X22，X32，X42对感官评分影响极显著（P＜0.01），X3和X4影响显著（P＜0.05），其他项不显著（P＞0.05），各因素对感官评分的影响顺序是X2＞X4＞X3＞X1，即发酵温度＞发酵时间＞接种量＞加糖量。在α=0.05水平上剔除不显著项，得到简化方程：Y=–989.48+43.18X2+4397.00X3+26.89X4–1.32X12–0.49X22–50933.33X32–1.57X42。

2.3.2 响应面分析

由图2可知，响应面的开口向下，而且当固定一个变量时，感官评分都会随着另一个变量的增大呈现出先增大后减小的趋势，响应曲面图越陡，说明所对应的实验因素对响应值的影响也越显著[18-19]，这与方差分析的实验结果一致。各因素在所选范围内均有最佳响应值，这说明实验因素所选范围是合理的。

2.3.3 最佳组合的确定与验证

图2 各因素交互作用对感官评分影响的响应面

利用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果分析，得到胡萝卜乳酸饮料的最佳工艺条件：加糖量6.55%，发酵温度42.66℃，接种量0.01%，发酵温度6.95 h，感官评分预测值为86.0142。考虑到实际可操作性，将配方调整为加糖量6.5%，发酵温度42.5℃，接种量0.010%，发酵温度7 h。为验证模型可靠性，于最佳条件下进行三次验证性实验，所得饮料的酸度为36.78°T、感官评分为88.79分，DPPH清除率为95.97%。

2.4 稳定性实验结果

由表6可知，当CMC∶黄原胶=1∶2时，乳酸饮料的沉淀率最小，稳定性最高，优于CMC∶海藻酸钠、黄原胶∶海藻酸钠的各处理（P＜0.01），故选择CM C与黄原胶比例1∶2的复合稳定剂。为改善产品风味，添加0.06%的柠檬酸进行调配，于最适条件下制备胡萝卜乳酸饮料，其酸度为37.85°T，感官评分95.05分，DPPH清除率96.32%。

2.5 产品品质指标

2.5.1 感官指标

色泽呈浅橘黄色，质地均匀、无分层和杂质、流动性好，有浓厚的胡萝卜香和轻微乳香、香气协调，口感细腻，滋味纯正，酸甜适口。

2.5.2 理化指标

蛋白质0.7%，总糖7.0%，可溶性固形物12.8%，酸度37.85°T。

表6 复合稳定剂添加比例对胡萝卜乳酸饮料稳定性的影响

2.5.3 微生物指标

乳酸菌≥106CFU/m L，大肠菌群≤1 CFU/m L，致病菌符合GB29921-2013[20]限量要求。

3 结论

以胡萝卜和牛奶为原料，制备了一种具有较强DPPH清除效果的胡萝卜乳酸饮料，所得最佳工艺参数为料水比（胡萝卜∶水）为1∶3，胡萝卜汁添加量85%，牛奶添加量15%，加糖量6.5%，乳酸菌接种量0.010%，发酵温度42.5℃，发酵时间7 h；最佳稳定剂组合是CMC∶黄原胶1∶2，添加量0.3%；柠檬酸添加量0.06%。所得乳酸饮料色泽呈浅橘黄色，具有浓厚胡萝卜香和轻微乳香，口感细腻、甜酸适口、滋味纯正。该饮料对DPPH自由基的清除率为96.32%，蛋白质含量为0.7%，总糖7.0%，可溶性固形物12.8%，酸度37.85°T。

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