离子液体-分散液液微萃取高效液相色谱法测定配方奶粉中VA

曹江平，邸宏伟，梁永锋，罗菊花，解启龙

(1.宁夏师范学院化学化工学院，宁夏固原756000；2.宁夏师范学院六盘山资源工程技术研究中心，宁夏固原756000；3.中国科学院山西煤炭化学研究所煤转化国家重点实验室，太原030001)

0 引言

维生素A（VA）是维持人体正常代谢功能所必需的脂溶性维生素之一，有维持视力、促进骨骼生长、细胞分化和抗氧化并增强机体抗感染能力的功能[1-3]。一般需从食物中摄取，肝脏、蛋类和乳品等动物源食品含有丰富的VA，是人体所需VA的重要来源[4-5]。婴幼儿配方乳粉中VA的含量是乳粉重要的营养指标之一，我国因此制定了测定其含量的国标方法[6]。目前，测定VA的方法主要有电化学法[7]、高效液相色谱法[8-12]、高效液相色谱-串联质谱法[13]和同位素稀释法[14-16]。

分散液液微萃取技术是一种环保型低溶剂萃取法[17-18]，因其诸多优点，近年来已广泛应用于食品及环境分析中[19-22]。但在配方奶粉中VA的分离分析尚未见报道，本文建立了基于离子液体的分散液液微萃取技术对配方奶粉中VA萃取，并结合高效液相色谱紫外检测技术测定其含量，并将此法成功应用于市售配方奶粉中VA的检测。

1 实验

1.1 材料与试剂

3种配方奶粉样品购自当地超市；VA标准品（CAS号:68-26-8，纯度95%，上海晶纯生化科技股份有限公司）；[C4M IM][PF6]、[C6M IM][PF6]、[C8M IM][PF6]离子液体（纯度99.0%，上海成捷化学有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，抗坏血酸、乙醇、氯化钠、氢氧化钾、硫酸钠、盐酸均为市售分析纯。实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；TA2204B型分析天平（上海精科天美科学有限公司）；PHS-3C型数字酸度计（江苏江分电分析仪器有限公司）；TDL-80-2B型离心机（上海市安亭科学仪器厂）；SENCO-R系列恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）；KQ-5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UPDR-II-20L超纯组合高纯水制取系统（四川优普超纯科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 标准溶液的配制

准确称取恒重的VA标准品5.0 m g，用甲醇溶解，定容至5 m L的容量瓶中，得1.0 m g/m L的VA储备液，4°C下保存；分别移取储备液50.0、100.0、150.0、200.0、250.0μL，分别用甲醇稀释并定容至5 m L容量瓶中，得浓度依次为 10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg/m L的VA标准系列溶液，现用现配。

1.3.1.2 KOH溶液的配制

准确称取恒重的KOH固体100 g，加入二次蒸馏水溶解并定容于100 m L容量瓶中，配成1 g/m L KOH溶液，现配现用。

1.3.1.3 工作液的配制

取50.0μg/m L标准溶液1m L用甲醇稀释并定容至50m L容量瓶，配成1.0μg/m L工作液，现配现用。

1.3.2 样品制备与分析

1.3.2.1皂化

准确称取配方奶粉5.0 g于250 m L的圆底烧瓶中，加入15.0 m L温度为40～50℃蒸馏水充分溶解。加入50.0 m L的无水乙醇，搅拌至颗粒分散均匀，依次加入1.0 g抗坏血酸，混匀，加入25.0 m L KOH溶液（1 g/m L）混匀，在恒温磁力搅拌器上控制水温53℃±2℃时，磁力搅拌皂化约45m in后，取出立刻冷却至室温，用二次蒸馏水洗涤烧瓶后合并洗涤液，离心取上清液并定容至100 m L，即得皂化液。

1.3.2.2 DLLM E

移取4.0m L皂化液于10 m L带旋帽的锥形离心管中，加入5.0 m L的二次蒸馏水稀释后，加入溶有等体积乙腈稀释的100μL[C8M IM][PF6]（萃取剂），轻摇5 m in并3 500 r/m in离心3 m in，离心后萃取剂形成微小的液滴并沉积于离心管底部，弃去上清液，加入100μL乙腈稀释后，用微量进样器准确吸取沉积在锥形管底部的微小液滴计量体积，供HPLC分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：V甲醇∶V水=100∶0；流速1.00 m L/m in；进样量20μL；紫外检测波长326 nm，柱温为室温。

2 结果与讨论

2.1 DLLM E条件优化

取1.3.1.3配置的1.0μg/m L工作液进行DLLM E操作，改变萃取条件，将所得样品上机测试，对比各平行条件下萃取液分析所得萃取回收率优化实验条件。其中，回收率按公式（1）计算。

式中：C s是萃取完成后离子液体中VA浓度（μg/m L），VS是萃取完成后离子液体体积（m L）；Cw是萃取前样品溶液中VA浓度（μg/m L），Vw是萃取前样品溶液的液体体积（m L）。

2.1.1 萃取剂种类和用量的选择

移取3.0 m L工作液于10 m L带旋帽的锥形离心管中，加入6.0 m L的二次蒸馏水稀释后，分别加入溶有100μL 3种离子液体萃取剂的100μL乙腈，对比萃取结果，如图1（a）所示，[C8M IM][PF6]的萃取效果明显好于[C4M IM][PF6]和[C6M IM][PF6]，因此选择[C8M IM][PF6]作为样品DLLM E的萃取剂。

萃取剂用量也影响实验效果，实验对比了50～150μL不同萃取剂用量对萃取率的影响。结果如图1（b）所示，萃取剂加入量从50μL增加到100μL时，萃取率呈增加的趋势，100～150μL萃取率不再增加甚至降低，这可能是由于离子液体在水中的溶解作用导致。可见，加入100μL萃取剂的萃取效果达到最佳，因此，选择萃取剂的用量为100μL。

图1 萃取剂种类（a）和用量（b）的选择

2.1.2 分散剂的选择

分散剂用量也影响萃取率，皂化液中含有乙醇可作为分散剂，实验分别考查了移取2.0～9.0m L工作液加入二次蒸馏水稀释到9.0 m L进行萃取。结果显示移取4.0 m L工作液加入5.0 m L蒸馏水稀释后做DLLM E效果最好，因此在DLLM E过程样品用量为移取4.0 m L样品液加入5.0 m L蒸馏水稀释。离子液体黏度大不便操作，需加入有机溶剂溶解稀释后使用，实验对比了分别加入等体积乙醇、乙腈、四氢呋喃和丙酮对[C8M IM][PF6]的溶解效果，结果显示乙腈效果最好，故实验选择加入萃取剂等体积的乙腈稀释离子液体，同时也做分散剂。

图2 分散剂用量的选择

2.1.3 pH值的选择

适当调节样品溶液的pH值，可以改变溶液的酸碱度，改变分析物的存在状态，从而影响萃取效率。VA为弱酸性物质，实验调节样品液至pH=3，pH=5，pH=7，pH=11比较对萃取效率的影响。实验结果如图3所示，样品液pH=3时，萃取效果达到最佳。因此，实验时将皂化液的pH调至3。

图3 溶液pH的影响

2.1.4 离子强度的比较

改变溶液的离子强度，会引起目标分析物在样品溶液中溶解度的改变。实验对比了不加N aC l和分别加入质量分数为5%，10%，20%，30%氯化钠对比其对萃取率的影响。结果如图4，不加NaC l时萃取率最高，随着N aC l加入量的增加，萃取率逐渐降低，因此本实验选择不加N aC l。

图4 离子强度的影响

2.2 方法学验证

2.2.1 线性、精密度和重现性

在优化的条件下，做了方法学实验，VA浓度在1.0～100.0μg/L线性良好，工作曲线的回归方程为Y=96.769x-6.7234(r2=0.9978)。为了验证方法的重现性，取实际样品分别做了日内和日间重现性，其精密度RSD分别为日内1.92%，日间5.35%。

2.2.2 加标回收率、检出限和定量限

3种配方奶粉样品做加标回收率实验，结果如表1和图5，加标浓度5μg/g和10μg/g，加标回收率为83.6～106.1%，RSD在1.86%～6.94%之间。方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别以S/N=3和S/N=10计，分别为2.2μg/L和7.3μg/L。

2.3 实际样品分析

为检验方法在实际样品中的适用性，运用该法在优化条件下对3种配方奶粉样品进行测定。结果如表1和图5，3种配方奶粉样品中VA含量分别为6.36μg/g、9.20μg/g、7.82μg/g，从回收率实验结果可以看出，此方法能准确测定配方奶粉中VA含量。

图5 标准品和实际样品色谱图

3 结论

本文建立了基于离子液体的分散液液微萃取法提取配方奶粉中的VA，并结合高效液相色谱法测定其含量，结果显示该方法测定配方奶粉中VA可取得满意结果。并将该方法成功运用于测定3种配方奶粉样品中VA的含量，所测枸杞样品中VA含量为6.36～9.20 μg/g。该法有机溶剂用量少，操作简单快捷，线性良好，回收率高，实际样品适用性强，可以为配方奶粉中VA的测定提供一定的技术参考。

表1 样品测定结果、加标回收率

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