冻藏过程中冰晶对水产品品质影响的研究现状

向迎春，吴丹，黄佳奇，余海霞，杨水兵，胡亚芹，，*

（1.浙江大学食品与营养系，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，浙江杭州310058；2.杭州知味观食品有限公司，浙江杭州311115；3.浙江大学舟山海洋研究中心，浙江舟山316021）

水产品因其高蛋白质、低脂肪的“白肉”特性，我国营养学会将其列入“中国居民膳食指南”，推荐人均每天摄入50 g～100 g，作为平衡营养，获取优质蛋白质的重要来源[1]。但水产品特殊的肌肉组分及生存条件，使其捕捞后比一般畜禽肉组织更易受到微生物污染，也更加容易腐败变质。因此人们极大地依赖于保鲜技术来贮运新鲜水产品。低温冷冻保藏作为目前为止水产品贮藏中最广泛应用的保鲜方式，能够较好地保持水产品的营养价值、风味并延长其货架期，极大地提高了水产养殖业的经济效益[2]。

冻藏过程中，低温可以抑制水产品肌肉组织中的酶活性及微生物的生长。但低于冰点的温度引起肌肉组织水分结冰，形成的冰晶破坏其细胞结构，使冻品组织、色泽、风味、营养等发生一系列变化，最终引起冷冻水产品品质的降低。加之目前冷链技术的缺陷，在实际捕捞运输、贮藏及销售过程中，温度的波动极易引起冻品发生反复冻融现象。在此过程中，冰晶的形成、融化以及重结晶使组织内小冰晶依附于大冰晶，引起冰晶数量的减少及个体体积的增大，从而造成细胞结构的破坏，并最终加速一系列理化感官品质的下降[2]。

近年来，低温冻结及贮藏过程中冰晶的形成长大对冻品肌肉组织的影响不断受到国内外学者的关注[3-4]。因此，本文旨在整理前人的研究，综述冻藏过程中冰晶的成核、长大以及此过程中水产品的一些理化性质的基本变化，其中包括冰晶在冻藏过程中的整个变化过程以及冻藏过程中组织营养、感官品质的变化，进而总结出冰晶形成对肌肉品质的影响。可为控制水产品在冻藏过程中不同时期冰晶的形成及生长情况，提高冻藏水产品品质、延长货架期提供理论依据。

1 冰晶在冻藏过程中的生长特点

在冻藏过程中，冰晶的产生及生成量是衡量水产品品质的一个非常重要的参数。其中，冰晶的形成分为成核及晶体长大两步，同时温度波动也伴随着重结晶现象的发生[5]。冰晶在形成过程中的成核、长大以及重结晶一定程度地影响着产品的最终品质。因此，了解冰晶在冻藏过程中的生长特点，阐明机制并对其实施相应的控制措施将极大地促进冻藏水产品品质的提高。

1.1 冰晶的生成

冰晶形成的初始阶段是晶核的形成，晶核一旦形成，冰晶在结晶驱动力的作用下就会快速生长。这种驱动力促使晶核吸附周围的水或水蒸气形成冰晶并不断长大。这是由于冻结后的水产品组织中存在固态的冰晶、液态的水溶液及气态的水蒸气3种不同形态，使组织内产生水蒸气压差，水蒸气从高向低流动以达到气压平衡，最终凝结到气压最低的大冰晶上[6-7]。在冰晶长大的过程中，固态冰晶的形成使肌肉组织细胞比表面积增大，造成细胞损害，从而引起组织内一系列生化反应的发生。最终引起水产品营养价值及食用风味的下降[8]。

水产品作为一个大的空间组织体，由无数细胞组成。阐明冻品中冰晶生成与细胞破坏之间的关系是提高冻品品质的关键，关于组织冷冻过程中胞内冰晶形成先发生还是细胞损伤先发生一直是研究者争论的话题。Mazur[9]和Toner等[10]认为胞内冰晶形成是导致细胞损伤的主要原因。胞内冰晶形成使胞内液体变成固体，化学势能的变化使胞内体积膨胀引起细胞损伤。Mazur表示产生于细胞外部的晶核，透过细胞膜上的微孔，细小的晶核向胞内生长引起胞内结晶。这是深受广大学者支持与应用的“孔理论”学说[11]。Toner等表示冰晶形成分胞内和胞外，胞内指在低温冻结时细胞内一些微小的物质直接促使胞内水分结晶；胞外指受细胞外部低温的影响，细胞外的溶液先达到冻结点开始成核结晶，胞外冰晶由于化学能的作用间接引起胞内结晶。而Muldrew等[12]的理论则认为细胞损伤先于胞内结晶，胞外先形成冰晶，在低温下胞外冰晶挤压细胞膜，使细胞膜受到机械压力和化学作用而损伤，从而使胞外冰晶直接通过破坏的细胞膜向胞内生长引起胞内结晶。

1.2 冰晶的重结晶

冰晶对温度的波动十分敏感。在冰晶形成中及形成后，周围环境的细小变化都极易引起数量、大小及形状的变化而产生重结晶现象。在水产品冻藏过程中，受热动力学效应影响，组织内水分子由小冰晶变成大冰晶，冰晶数量减少，表面能降低，从而发生重结晶[13]。另外贮藏温度发生波动时，温度在升温又降温过程中小冰晶变小、消失，大冰晶继续长大，这个过程对肌肉细胞又一次产生机械损伤。在恒温时组织中一些水蒸气从高蒸汽压区域向低蒸气压区域转移，冰晶产生重结晶对组织造成再次破坏[14-15]。

因此在冻藏过程中有目的地抑制晶核的形成、促进冰晶的快速生长或者避免冰晶的重结晶都能更好地延缓冻品品质的劣变。

2 冰晶对水产品品质的影响

在低温冷冻保藏过程中，水产品随着贮藏温度的下降及贮藏时间的延长，肌肉组织通过最大冰晶生成带，水分相继冻结。其中肌体内的蛋白质、脂肪、组织液、质构、色泽以及微生物数量等一系列指标发生相应变化[16]，最终影响水产品的口感及风味，降低其营养与经济价值。冰晶是影响此过程品质变化的关键因素。冰晶形成的时间、大小、形态以及分布均与冻藏中的组织变化密切相关，从而影响着产品的营养与感官品质[17]。

2.1 冰晶对营养品质的影响

2.1.1 冰晶对蛋白质的影响

动物性水产品的蛋白质含量仅次于组织内水分含量，它参与构成生物体及完成肌体生命活动，从而影响着水产品肌肉组织的形态及品质变化。在肌肉蛋白质中，盐溶性的肌原纤维蛋白含量最高，占蛋白总量的65%～75%[2]。研究者常常根据肌原纤维蛋白的变化来评价蛋白质的变性程度。在水产品的冻藏过程中，蛋白质变性引起肌原纤维蛋白结构特性及功能性质的降低，从而使影响着产品的口感、风味、营养及商用价值。冻藏中的肌肉组织蛋白质变性，很大程度上取决于组织中冰晶生成对其的影响。冻藏过程中形成大小不同的冰晶均对细胞膜及细胞的组织结构产生破坏，进而加速蛋白质的变性[18-19]。

关于蛋白质的冷冻变性目前尚无定论，主要有“细胞液浓缩学说”、“结合水分离学说”及“冰晶破坏作用学说”3种假说。

“细胞液浓缩学说”基于水分结冰而使细胞液浓度升高提出。在冻藏条件下，组织中的自由水与结合水相继冻结，导致细胞液的离子浓度升高，离子强度及pH值改变，促使部分物理化学性质的变化以及冰晶破坏细胞内外的组织结构，蛋白质分子最终发生不可逆的改变[20]。Kaale等[21]研究发现，大西洋鲑鱼在第3天组织内冰晶达到最大值，其后冰晶变化不大，而盐溶性蛋白在微冻第7天到第14天下降明显，说明冰晶间接影响着品质变化。

“结合水分离学说”认为水产品在冻藏初期，组织内自由水先于结合水结冰，随着冻藏时间的延长，未冻结的水分子在驱动力作用下向晶体聚拢，冰晶不断长大，大量结合水分子的减少最终使游离出来的功能基团相互作用发生聚集变性。特别是在慢速冻结过程中，形成的冰晶影响水分子的正常分布，解冻后的结合水与自由水不能回到最初位点，复水力下降导致蛋白质变性加剧[22]。图1[23]为蛋白质聚集变性模型。

图1 蛋白质冷冻凝聚变性模型Fig.1 Model of protein denaturation of freezing aggregation

此模型充分描述了此学说的变性过程。螺旋结构的蛋白质在一定低温下，部分水分子开始结晶。蛋白质分子中的侧链在冰晶的挤压下发生聚集，蛋白质周围的游离水分子因重新排布而失去复水力，从而导致蛋白质变性[22]。汪秋宽等[24]研究发现，经过冻藏的鲤鱼盐溶性蛋白减少，经过SDS-PAGE采用电子显微镜观察发现冻藏过程中鲤肌肉纤维出现裂缝和间隙，肌原纤维蛋白空间结构发生改变，说明在鲤鱼冻藏过程中组织冰晶增大而使肌原纤维蛋白的脱水变性。

“冰晶破坏作用学说”则认为冰晶的形成改变了结合水与蛋白质的结合状态，使蛋白质内部键展开，重新生成二硫键、氢键、离子键等一些新键，蛋白质分子内部构造改变，从而使蛋白质变性[25]。图2为非螺旋结构或球形结构的蛋白质在冻藏中的展开变性[23，26]。

图2 蛋白质开链变性模型Fig.2 Model of protein denaturation of unfolding

未冻结时，部分蛋白质分子以高度水化的折叠状存在，非极性基团相互作用形成非极性键，因为位于分子内部而避开与水分子的接触，所以状态比较稳定。低温冻结时，冰晶的形成使蛋白质水化程度降低，蛋白质分子展开变性。此学说较好地结合了蛋白质结构与价键变化的关系，常被学者用来研究细胞内外冰晶生长状态及生成量与蛋白质变性间的关系，在冷冻变性解释中运用最为广泛。袁丽等[27]用拉曼光谱技术分析凡纳滨对虾肌肉蛋白质在不同冻藏温度下的二级结构，表明冰晶形成使蛋白质结构改变，暴露出的活性巯基被氧化成二硫键，使结果中巯基含量减少而二硫键含量增加；而且发现冻藏温度越高蛋白质结构松散越明显。Benjakul等研究发现在冻藏过程中，软壳蟹其总巯基含量大幅下降。其在石首鱼、鲅鳊鱼研究中也得到相似结论[28]。姜晴晴等[29]的研究表示随着冻融循环次数增加，蛋白羰基含量显著增加而巯基含量显著下降，这可能与反复冻融冰晶不断长大对组织的破坏程度有关。

以上冷冻变性学说很好地解释了冰晶形成对蛋白质的影响。总归可以解释为：冻藏过程中冰晶的生成影响着蛋白质结构特性的改变，其中主要引起肌原纤维蛋白结构特性的变化，进而引起功能特性的改变及品质下降。形成的冰晶挤压并刺破细胞导致胞内的酶外泄流失引起酶活性的降低。水分子凝结成冰引起离子浓度升高及加速生化反应的发生，使肌原纤维蛋白含量下降。蛋白质变性最终表现为肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性减弱、盐溶性含量减少、总巯基含量降低及二硫键含量增加等[21，27，30-34]。Benjakul等[28，35]研究发现在冻藏过程中，黄花鱼、蜥鱼、软壳蟹等的Ca2+-ATPase活性随冻藏时间延长而降低。郭园园等[36]在对鲢鱼的研究中也得出了相似结论。Wu等[37]在不同温度下冻藏大头鲤鱼，温度越低其盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性和总巯基含量越高，说明冻结时温度越低，形成冰晶越细小均匀，蛋白质的变性程度越小。这些明显的蛋白质变化都是由冰晶直接作用引起，从而间接影响着水产品品质[18]。林婉玲等[38]研究表示浸汁冻结速度快，形成的小冰晶对组织损伤小，肌球蛋白中暴露的疏水基团相对少，Ca2+-ATPase活性及巯基氧化程度都相对较小，因此蛋白质变性程度低，冷冻草鱼的品质更好。鲁耀彬等[26]研究表示盐溶性蛋白中结合水结冰导致蛋白析出，促进疏水键和氢键的形成引起蛋白变性。为了减轻冰晶对蛋白质的影响，大量研究者采用抗冻剂来抑制冰晶对蛋白质的破坏。Badii等[39]在冻藏鳕鱼片时添加蔗糖及山梨醇抗冻剂比直接冻藏鳕鱼片蛋白质提取率高，说明抗冻剂可以减少冰晶的生成，延缓蛋白质变化。马璐凯等[31]通过添加海藻糖等抗冻剂抑制了虾仁组织内冰晶对其的机械破坏，从而防止了肌球蛋白重链发生变性。

2.1.2 冰晶对脂肪的影响

大多数水产品富含高不饱和脂肪酸，机体极易受脂肪氧化引起品质劣变。水产品在冻藏过程中冰晶形成对脂肪氧化的影响不容忽视，脂肪的氧化间接地改变鱼体的水合性、组织结构、颜色及风味等一系列营养品质。水产品在冻藏过程中，低温使大部分水分冻结成冰从而抑制组织活性，但部分未冻结水仍然会引起一系列生物化学反应的发生[40]，脂肪氧化就是其中极易发生的一种。研究表明，在冻藏温度高于-20℃时，组织中有部分未冻结水，这很可能是引起脂肪氧化的重要原因[41]。而且组织中的水分结晶引起细胞内外的溶液浓度升高，从而增加了冻藏过程中未冻结溶液的反应。其次，冰晶对肌体细胞膜及细胞器造成机械损伤，其中的血红素铁等一些促氧化物质得以释放，引起脂肪的氧化[42-43]。在超低温条件下，组织表面冰晶升华留下微小的孔洞，增大了组织内部与氧气的接触面积，从而引起组织脂肪酸败及羰氨反应的发生。另外，组织中的脂肪酸还会由于冰晶的压力作用从内部转移到表层，使其很容易与空气中的氧气发生作用而腐败。脂肪氧化又往往同蛋白质的分解产物如氨基酸、盐基氮以及冷库中的氨共存从而造成水产品的色香味严重变化。冻融过程冰晶破坏细胞使一些抗氧化酶类流失，也会使脂肪氧化。

在水产品中，硫代巴比妥酸值（TBA）常被人们用来评价脂肪氧化的程度。Hong等[44]对大头鲤鱼进行不同方式冻藏保鲜，其中冻藏温度越低，温度波动越小，冰晶体形成越小，相应TBA值最小。但是一直-18℃贮藏比先-40℃再-18℃储藏TBA值增长较大，这应该与冻结速率引起的冰晶大小有密切关系。Sarkardei对竹荚鱼的研究也有类似结果[45]。Burgaard等对虹鳟鱼在不同温度冻藏条件下的肌肉品质测定表明，-10℃和-20℃的慢速冻结条件下，脂肪酶的释放引起脂肪氧化，这可能是慢速冻结形成的大冰晶对细胞的破坏导致溶酶体析出所致[46]。郑振霄等[47]用海水预冷24 h再冻藏，TBA值明显低于直接冻藏和直接海水保鲜，因为海水预冷再冻藏有效缩短了温度通过最大冰晶生成带的时间，而且海水预冷使鱼体表面形成一层冰衣也抑制了脂肪的氧化[48]。姜晴晴等研究表示反复冻融过程中的结晶与重结晶生成的大冰晶对组织损伤引起一些氧化酶汁液的流失，大大增加了脂肪氧化几率[29]。

2.1.3 冰晶对水分的影响

水分含量是评价水产品新鲜度的一个重要特征，是水产品维持其活体状态的最基本指标。冻藏改变了组织中水分的分布及含量，从而引起组织结构改变以及一些生化反应的发生。在水产品的冻藏过程中，液态水的减少是冰晶形成最直观的表现。其次水产品冻结中的冰晶从固态变成气态，水产品组织内水分子减少，组织表面水分发生干耗使组织重量减轻、组织表面失去透明感以及组织变得干柴，从而引起冻品品质下降[49]。

对于肌肉组织水分含量的评定，人们常用液滴损失、蒸煮损失率及持水性等指标来评定[50]。冰晶形成和生长对组织细胞结构的机械损伤，使细胞破裂以及组织间隙增大，造成冻结水产品解冻后汁液流失，持水性下降。冻藏中汁液损失很大程度上取决于冻结速率以及冻藏温度，冻结速度越快，冰晶形成越细小均匀，相对缓慢冻结造成的液滴损失较小。Maria[46]等对虹鳟鱼用不同冻结速率进行冻结，冻结速率越快，鳟鱼液滴损失越小持水性越强，分别在不同温度下进行保藏发现，-10℃和-20℃比其它更低温度的液滴损失大。此结果与其对鳕鱼相同处理条件下结果一致[5]。Hu等[51]研究表明冰箱直接冻结相比液氮冻结速度慢，形成的冰晶大，导致持水性低于液氮冻结。Rodezno等[52]对鲶鱼进行快速低温冻结和慢速鼓风冻结发现，快速低温能使鲶鱼更快通过最大冰晶生成带，水分流失相对鼓风冻结流失小。此结果与Boonsumrej[53]和Campañone等[54]的报道结果相似，即慢速冻结形成更大冰晶，损坏细胞导致水分流失更多。郝淑贤等[55]研究表示快速冻结能使组织更快通过最大冰晶生成带，形成的冰晶小，细胞破坏相对更小，所以-80℃的快速冻结比-18℃的慢速冻结液滴损失小。但是，目前国内外的研究对于水分损失率尚没有一个通用标准，研究者由于不同的目的使用不同的方法，从而很难直观地从文献中得出统一结论。

张强等[56]测量不同温度条件下冻藏的凡纳冰对虾解冻损失率，发现前15天，-5℃微冻虾的液滴损失率最小，组织形成冰晶较少，而-18℃冻结形成冰晶最大，液滴损失率最大，-35℃和-60℃次之。而15天后-5℃损失率高于-60℃，可能是随着贮藏时间延长，微冻虾也有大量大冰晶形成破坏组织。Xia等[57]研究认为水产品解冻时的汁液流失与组织在冻藏中冰晶长大及冻融过程中重结晶所受到的机械损伤有关。冻品解冻过程中蛋白质、脂肪和矿物质等随着冻品汁液的流失而减少，造成水产品营养品质的下降。袁丽等[27]研究认为，冻藏温度越高，表层结合水与蛋白质的作用越弱，导致蛋白质周围水分流失更严重。

2.2 冰晶对感官品质的影响

2.2.1 冰晶对色泽的影响

色泽是消费者对水产品进行评价的最直观的指标，色泽好坏直接影响消费者的购买欲。冰晶引起的组织破坏以及冻结过程中肌红蛋白的氧化、脂肪的氧化、水分的蒸发等理化性质的变化都影响着色泽的改变[58]。冰晶的形成引起组织液溶度的升高，色泽也因此加深。

人们常采用L*代表黑白色度，a*代表红绿色度，b*代表黄蓝色度来综合评价食品中的色泽变化。张强等对凡纳冰对虾在不同温度下冻藏表明-35℃和-60℃的快速冻结色差与亮度值相对于-5℃的慢速冻结变化小，这可能与冰晶对虾肌体的损伤程度有关。Thanonkaew等[58]研究表示色泽变化不仅与冰晶引起的汁液流失有关，而且与冰晶引起的一系列理化变化有关，脂质的氧化、蛋白质的变性都极大地影响着色泽的变化。姜晴晴等[56]研究反复冻融的带鱼表示，随着冻融次数的增加，脂肪氧化及蛋白变性更严重，伴随着色泽逐渐消失，肌肉切面变暗淡。史策等[59]对鲢鱼反复冻融后，冰晶对组织的破坏使鱼肉的L*值和b*值均逐渐增大，色泽发生劣变，肉的可接受程度降低。郝淑贤等[55]研究表示-80℃冻结组比-18℃冻结组虾仁溶解后的L*值更低，可能是因为-18℃冰晶形成更大，导致持水性下降，溶解后组织表面游离水增加，对光的反射性增强引起L*值更高。马璐凯等[31]用海藻糖、海藻胶寡糖及焦磷酸钠处理虾仁比没有抗冻剂处理后冻结，明度L*明显减小，这表明处理后虾仁内的冰晶对组织损伤较小，抗冻剂有抑制冰晶破坏细胞的作用。

2.2.2 冰晶对质构的影响

质构作为消费者最直观的品质感受，常被研究者作为水产品品质评价的重要指标[60]。水产品组织随着冻融过程发生相应变化，冻藏中冰晶的形成重结晶是影响其变化的主要因素。冰晶形成使组织液态水减少，组织比表面积增大对组织细胞造成机械损伤，细胞间隙增大，从而使肉质失去弹性，组织软塌[29，57-58]。在冻结过程中，水产品因为组织水分转化为冰，质地变硬。其中的硬度与冻结水量的多少相关，组织在结晶变硬后剪切力变大、嫩度降低、口感变差[61]。

人们一般采用硬度、弹性、脆性、剪切力等的变化大小来评价质构的变化。张强等[56]对冻藏凡纳滨对虾研究表明冻藏温度越高，硬度增加越大，咀嚼性及弹性下降越明显。姜晴晴等[56]对带鱼的冻融研究中发现随着冻融次数增加，冰晶重结晶现象越严重，硬度、咀嚼性、弹性都下降明显。Hu等[51]通过电镜观察不同冻结条件下带鱼微观组织结构，发现液氮速冻肌肉横切面更光滑平整，这可能是更快冻结速率下肌肉组织冰晶越小，对细胞的破坏程度越小。Badii等[39]在冻藏鳕鱼片时添加蔗糖及山梨醇抗冻剂比直接冻藏鳕鱼片210天后肉质更柔软。说明抗冻剂可以减少冰晶的生成，延缓质地变硬。

3 结论

冷冻保藏延长了水产品的货架期，较好地保持了水产品的营养价值及风味。但与此同时，冻藏过程中冰晶的形成对水产品肌肉组织的损害影响着水产品的品质。因此，提高冻结速率及改善冻结过程以减小冰晶的大小及生成量，减少冰晶对组织的损害是提高冻品品质极其有效的方法。目前人们尝试使用抗冻剂、抗氧化剂等生物保鲜剂辅助冻结，高压电场、超声等机械设备辅助冻结，减小最大冰晶生成带的生成时间，对水产品冻藏保鲜起到了一定成效。尚需通过进一步阐明冰晶形成机理与水产品品质变化间的关系，有目的地抑制冰晶的形成来提高冻藏水产品品质，进一步增加日渐衰竭的水产资源的有效利用率。

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