白头翁与蛴螬不同配伍比例体外抗病毒作用研究

颜娓娓，徐佳馨，王继锋，崔真真，史晨晓，周长征

（1.山东中医药大学，济南 250300；2.山东中医药大学药学院，济南 250300）

白头翁，别名胡王使者、白头公，始载于《神农本草经》，为毛莨科植物白头翁的干燥根。《中药大辞典》认为，其“味苦，性温”[1]，具有清热凉血、解毒等功效，用于治疗结肠炎，慢性腹泻，消化性溃疡，血痔，滴虫性阴道炎等[2]。目前，研究[3-6]发现，白头翁有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗滴血虫、杀精、保肝、抗病毒等药理作用。蛴螬，别名土蚕、核桃虫，始载于《神农本草经》，是金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子及同属近缘昆虫的干燥幼虫。《中药大辞典》认为，其“味咸，微温”[1]，具有破血、行瘀、散结、通乳等功效，用于治疗丹毒、目翳、痈疽、痔漏等[7]。现代药理学研究[8-9]表明，蛴螬具有治疗眼疾、抗肿瘤、保肝、抗菌、抗肠道EV-71病毒等作用。呼吸道合胞病毒（RSV）是引起婴幼儿下呼吸道感染最主要的病毒病原；是一种单负链RNA病毒，属于副黏液病毒科肺炎病毒属，包括A、B 2种亚型。据WHO估计每年约有6 400万儿童感染RSV，其中约有16万例死于RSV相关疾病[10-11]。肠道EV-71病毒主要通过粪-口途径传播，人类是目前已知的唯一宿主[12]。本实验采用白头翁、蛴螬抗病毒所筛选的最佳工艺进行提取、分离、配伍，并做体外抗病毒实验，测定各配伍比例体外抗病毒的TI值。

1 材料与方法

1.1 材料 1）设备：旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司）；二氧化碳细胞恒温培养箱（美国FOMAS公司）；二氧化碳病毒恒温培养箱（上海跃进医疗器械一厂）；超净工作台（上海力申科学仪器有限公司）；高速台式离心机（TD5M型，长沙湘智离心机仪器有限公司）；CKX-31倒置显微镜（Olympus公司）；荧光倒置显微镜（Olympus公司）；MK3酶标仪（Labsystems公司）；96孔细胞培养板（美国Corning公司）；液氮罐（四川液氮罐厂）。2）药品：白头翁（吉林国安药业有限公司）；蛴螬（吉林国安药业有限公司）。3）病毒株与宿主细胞 ：呼吸道合胞病毒、肠道EV-71病毒（引自中国疾病预防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室）；MA104细胞（山东省医学科学院基础医学研究所微生物室提供）。4）主要试剂：1640细胞培养液（美国GIBCO产品，含质量分数为10%牛血清）；1640细胞维持液（美国GIBCO产品，含质量分数为2%牛血清）；PBS磷酸盐缓冲溶液（自制）（含 Na Cl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO42.9 g，加三蒸水至1 L，过滤除菌，分装置 4℃ 备用）；EDTA-0.25%胰酶（Amresco公司）；0.1%中性红染料（上海化学试剂三厂）；中性红脱色液。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液制备

1.2.1.1 白头翁与蛴螬提取物的制备 称取白头翁50 g，分别加入10、8倍水回流提取2次，时间分别为2、1.5 h，趁热抽滤、合并滤液，将滤液减压浓缩至50 mL，装入EP管中贴标签备用；称取蛴螬50 g，分别加入12、10倍水煎煮提取2次，时间分别为2 h，趁热抽滤、合并滤液，将滤液减压浓缩至50 mL，装入EP管中贴标签备用。

1.2.1.2 水提醇沉 量取白头翁提取液30 mL，向其缓慢加入体积分数为95%的乙醇并快速搅拌，调节乙醇浓度至70%；冷藏静置24 h、抽滤、向滤饼中加入适量水超声溶解，并浓缩至质量分数为1 g/mL，装入EP管中贴标签备用。量取蛴螬提取液30 mL，向其缓慢加入体积分数为95%的乙醇并快速搅拌，调节乙醇浓度为50%；冷藏静置48 h、抽滤、向滤饼中加入适量水超声溶解，并浓缩至质量分数为1 g/mL，装入EP管中贴标签备用。

1.2.1.3 大孔树脂的预处理和上样 称取X-5型大孔树脂200 g，先用95%乙醇浸泡24 h，再将浸泡溶胀好的大孔树脂以湿法装柱，用足量的蒸馏水冲洗至无醇味；用体积分数为5%HCI溶液浸泡3 h，用蒸馏水冲洗至流出液为pH呈中性；用体积分数为5%的NaOH溶液浸泡3 h，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性，密封，备用。

称取D101型大孔树脂200 g，同上处理。将2.1.2中白头翁水提醇沉的沉淀溶解液加入X-5型大孔吸附树脂柱中，使其药液液面高于树脂柱上表面2 cm，静置1 h；分别以蒸馏水，体积分数分别为25%、50%、75%的乙醇为洗脱液进行洗脱，控制流速为3BV/h，每一洗脱液冲至无色，装入EP管中，贴标签备用。将1.2.1.2中蛴螬水提醇沉的沉淀溶解液加入D101型大孔吸附树脂柱中，同上处理。

1.2.1.4 白头翁与蛴螬配伍 将白头翁、蛴螬大孔树脂吸附法流出液水1部位进行配伍，调节白头翁水1部位与蛴螬水1部位分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1，装入EP管中，贴标签备用。

1.2.2 体外抗病毒实验

1.2.2.1 细胞的复苏及培养 将液氮罐中的MA104细胞冻存管取出，投入37～40 ℃的温水中迅速搅拌使冻存液溶化（尽量在1 min内完成溶解）；将冻存管于800 r/min的条件下离心5 min，在超净工作台内取出弃去冻存液；在细胞沉淀中加入适量10%的1640细胞培养液混匀，转移到培养瓶内，补加10%的1640培养液至12 mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.25%胰酶消化，将MA104细胞进行1:2传代，待细胞长成单层时用于实验。

1.2.2.2 病毒的扩增 1）呼吸道合胞病毒（RSV）的扩增：将病毒毒株200 µL接种于已经长成单层的MA104细胞上，吸附5 min后加入12 mL 2% 1640置37 ℃、5% CO2病毒培养箱中培养并设细胞对照，其中细胞对照相同操作将毒株换成1640维持液。待细胞的病变率达到90%以上时，取出，反复冻融3次，吹打离心（5 000 r/min，5 min），取上清液定量分装于西林瓶中，胶布封口，放于- 80 ℃冰箱冻存备用。2）肠道EV-71病毒的扩增：将病毒毒株400 µL接种于已经长成单层的MA104细胞上，吸附15 min后加入12 mL2% 1640置37 ℃、5% CO2病毒培养箱中培养并设细胞对照，照1.2.2.2中方法1）进行处理，冻存备用。

1.2.2.3 测定方法 将各供试品用质量分数为2%的1640细胞维持液分别作2倍比系列稀释共12个稀释度，设3个复孔，依次每孔加入50 µL横向接种于已长成单层的病毒宿主细胞的96孔板中，每孔再加入100倍TCID50的RSV病毒50 µL，同时设病毒对照组、细胞对照组及药物毒性组，并设3个复孔。同法处理，每孔加入100倍TCID50的EV-71病毒50 µL，同时设病毒对照组、细胞对照组及药物毒性组，并设3个复孔。置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每日观察细胞病变，待病毒对照组出现90%以上的病变时，用电子显微镜仔细观察，找出较为有效的部位。将96孔板中的培养液轻轻拍出，每孔加入100 µL中性红染液，放入37 ℃条件下反应1 h后取出，倒出中性红染液，小水流冲洗3～5次，每孔加入100 µL脱色液，恒温箱放置15 min，用酶标仪在540 nm波长下测定OD值[13]。

1.2.2.4 病毒毒力的测定 按照常规病毒毒力的测定，选择常用的病毒毒力测定时间为48 h作为测定时间测定实验所需病毒的毒力。根据Reed-Muench公式计算病毒液的半数感染浓度（TCID50）。1）测定方法：将病毒用维持液做12倍比系列稀释不同浓度，纵向重复3孔依次接种于已长成单层的宿主细胞的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5% CO2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下逐日观察，连续观察4 d，加1%中性红50 µL置37 ℃条件下染色1 h，弃染液，用蒸馏水将多余染液充分洗涤，加脱色液100 µL，室温脱色10 min，用酶标仪在540 nm波长条件下测定OD值。细胞存活率=实验组OD值/细胞对照组平均OD值×100%。细胞病变率= 1-细胞存活率。细胞比距=（高于50%病变率- 50%）/（高于50%病变率-低于50%病变率）。TCID50= Antilog（高于50%细胞病变率稀释度的值+比距）。测定结果：病毒在宿主细胞的TCID50值测定结果，见表1。

表1 各病毒的TCID50

2 结果

应用Reed-Muench方法计算药物半数有效浓度（EC50）和治疗指数（TI）。EC50= [Antilog（高于50%存活率药物稀释度的值-比距）]×C，TC50= [Antilog（高于50%病变率药物稀释度的值-比距）]×C，TI =TC50/EC50。白头翁与蛴螬不同配伍比例对抗呼吸道合胞病毒和抗肠道EV-71病毒的作用结果，见表2、表3。表2 白头翁、蛴螬不同配伍比例抗呼吸道合胞病毒结果

配伍比例 TC50 EC50 TI 1:9 2-2.1 - -2:8 2-2.1 - -3:7 2-2.3 2-5.4 9.190 4:6 2-2.0 2-5.0 8 5:5 2-2.3 - -6:4 2-2.0 2-6.1 17.148 7:3 2-2.1 2-6.1 16 8:2 2-2.2 2-4.15 3.864 9:1 2-2.1 2-7.1 32

表3 白头翁、蛴螬不同配伍比例抗肠道EV-71病毒结果

结果显示，白头翁、蛴螬配伍后抗肠道EV-71病毒的整体效果优于抗呼吸道合胞病毒；其中，白头翁与蛴螬配伍比例为8:2时抗肠道EV-71病毒效果最好，TI = 68.594.

3 小结

病毒性疾病具有发病率高、对抗生素类药物不敏感等特点，而中药作为资源丰富的传统药材，毒副作用小，具有广泛的研究价值[14]。

本实验研究只是证明了白头翁与蛴螬配伍对肠道EV-71病毒有良好的抑制作用，且筛选出最佳配伍比例为白头翁：蛴螬= 8:2；在后续的研究中将会对白头翁与蛴螬配伍抗病毒作用机制进行深入探究。中药抗病毒的作用机制主要可归纳为：直接杀灭病毒或降低病毒毒力；阻止病毒的吸附及侵入；抑制病毒的DNA或mRNA的转录和复制；抗氧化作用；调节细胞因子的产生等[15-17]。随着研究的深入，必能阐明抗病毒的具体作用机制并分离出有效单体。

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