不同炮制方法对连翘中连翘苷及连翘酯苷A含量的影响

韦永浩，周 安,2*，韩荣春,3*，俞年军，郭俊锋，曹 勇，朱月健，宋四清

（1.安徽中医药大学，合肥 230012；2. 新安医学教育部重点实验室，合肥 230038；3. 安徽省高校科研创新平台团队 中药饮片产地加工与炮制一体化关键技术研究创新团队，合肥 230012；4. 陵川县农业综合开发局，山西 晋城 048300；5.安徽济人药业有限公司，安徽 亳州 236800；6.山西九州天润道地药材开发有限公司，山西 晋城 048300）

连翘药材分青翘和老翘，为《中华人民共和国药典》（简称《药典》）所收载，味苦、微寒，有清热解毒、疏风散结之功[1]。其主要化学成分包括木脂素类、黄酮类、挥发油类和苯乙醇苷类。现代药理学研究[2-3]证明，以连翘酯苷为代表的生物活性物质对认知障碍有明显的治疗作用，同时在抗菌抗炎、解热、降脂保肝、抗氧化及防耳毒性方面也有广阔的应用前景。连翘在我国分布广泛[4]，目前连翘质量标准研究主要集中在不同地区连翘药材道地性、适宜采收期以及基于HPLC和UPLC等的指纹图谱分析方面[5-10]。连翘酯苷在连翘中的含量较高[11-12]，国家标准规定以干燥品计，连翘苷和连翘酯苷A含量不得低于0.15%和0.25%，并且两者的含量测定分开。本研究通过采集道地产区青翘，分别以蒸汽、水煮及生晒方式进行加工后，利用岛津LC-16的双波长模式，以连翘苷和连翘酯苷A为考察指标，将不同炮制方法对药材品质影响进行评价，为有效监测和提高连翘品质提供参考。

1 材料

岛津LC-16高效液相色谱仪（日本岛津公司），AS20500BDT型超声清洗器（Auto Science），DFY-300多功能高速中药粉碎机（温州顶历），甲醇色谱纯、乙腈色谱纯（瑞典Oceanpak公司），冰醋酸色谱纯（上海阿拉丁试剂），Cascada超纯水系统（北京颇尔），实验使用的其他试剂均为分析纯。连翘苷（批号110821-201615，纯度＞94%），连翘酯苷A（批号111810-201606，纯度＞93%）标准品购自于中国食品药品检定研究院。

连翘药材采集于山西陵川县及河南辉县，经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定为木犀科植物连翘Forsythia suspense（Thunb.）Vahl的干燥近成熟果实（青翘）。收集的连翘标本存放于本校生药系实验室，地理位置及海拔数据，见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[1]ACQUITY UPLC BEH Amide C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流动相乙腈- 0.3%冰醋酸（15:85），流速1.0 mL/min；连翘苷检测波长277 nm，连翘酯苷A检测波长330 nm；柱温30 ℃。对照品HPLC图谱。

表1 连翘样品采集信息

2.2 对照品溶液制备 精密称取连翘苷对照品1.83 mg，以70%甲醇为溶剂溶解于2 mL量瓶中，摇匀；同法称取连翘酯苷A对照品4.45 mg，以70%甲醇溶解于10 mL量瓶中，摇匀。因连翘酯苷A不稳定，对照品溶液在临用时配制（4 ℃冰箱保存）。

2.3 连翘炮制方法

2.3.1 蒸汽杀青组 本组影响因素主要包括蒸汽温度与蒸制时间。参考九州天润道地药材开发有限公司生产实践中总结的经验，将样品置入以常压加热超纯水至沸腾所产生的蒸汽（100 ℃）中，样品堆积厚度为5 cm，蒸制12 min后立即将样品移出，置于竹片编成的盛器中沥干水分后，在60 ℃烘箱中烘干备用。

2.3.2 水煮杀青组[13]加水量和煮制时间与结果有高度相关性。本实验采用物料与水1:6方式，每份样品500 g，待容器中加热的超纯水（600 mL）沸腾后，放入连翘，煮制8 min。取出沥干水分，烘箱中60 ℃烘干备用。

2.3.3 生晒组 将连翘样品置于可全天接受日光直晒的干净水泥地面上，生晒期间气温29～40 ℃，地表温度35～66 ℃。待样品干燥后，留存备用。

2.4 供试品溶液制备 取连翘样品粉末（60 ℃干燥40 min）约0.5 g过3号筛，精密称定，置于具塞广口瓶中，按照30:1的料液比加入70%甲醇溶液，超声30 min，频率40 Hz，功率250 W。超声结束，提取液冷却至室温，用70%甲醇溶液补足失重。过滤，取续滤液，用移液枪精密吸取10 μL，置于2 mL EP管中，蒸汽杀青组和水煮杀青组分别用提取溶剂稀释100倍，生晒杀青组用提取溶剂稀释10倍，全部用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为药材供试品备用。

2.5 线性关系考察 配制系列浓度的连翘酯苷A（临用时配制，并于4 ℃冰箱中保存）和连翘苷对照品溶液，精密吸取20 μL对照品溶液，注入液相色谱仪，平行进样2次，以溶液浓度对峰面积积分值进行回归，2个成分的线性关系，见表2。

表2 连翘中2种成分的线性关系

2.6 精密度考察 分别取连翘苷及连翘酯苷A对照品溶液20 μL，连续进样6次并记录峰面积和保留时间；结果表明，连翘苷、连翘酯苷A的峰面积RSD值分别为0.94%和1.5%；保留时间RSD值分别为1.4%、2%。提示仪器精密度良好。

2.7 重复性考察 精密称取S2号样品6份，按2.4项下方法分别制备供试品溶液，按上述连翘苷及连翘酯苷A分析色谱条件依次进行检测，记录峰面积。计算得到连翘苷、连翘酯苷A含量RSD值分别为1.2%和1.4%。表明提取及检测方法重复性良好。

2.8 稳定性考察 取S2号供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24 h进样分析，记录峰面积。测得连翘苷、连翘酯苷A峰面积分别为1.7%和1.9%。表明供试品在24 h内稳定性较好。

2.9 加样回收率试验 将S2号样品2种指标性成分经HPLC分析明确其含量后，加入精密称重的连翘苷和连翘酯苷A对照品，分别按2.4项下制备以获得待测加样回收样品，高效液相仪测定后计算回收率。连翘苷加样回收率为95.2%～97.4%（平均值回收率为96.3%，RSD为1.4%）；连翘酯苷A加样回收率为95.1%～98.8%（平均值为97.0%，RSD为1.9%）。

2.10 连翘苷及连翘酯苷A含量测定 分别取20 μL对照品及样品溶液依次注入HPLC仪进行分析，记录其色谱图，蒸汽杀青、水煮杀青及生晒组连翘特征HPLC图谱。使用外标一点法计算不同炮制方法得到的样品中连翘苷和连翘酯苷A含量，结果见表3。

表3 不同炮制组连翘苷及连翘酯苷A含量

2.11 统计学分析 采用3.3.1版本R软件[14]进行数据分析。对3种不同炮制方法计算得出的连翘苷含量数据进行Bartlett χ2检验，提示3组样本总体方差不等，连翘苷组P = 0.001＜0.05；连翘酯苷A组P = 0.001＜0.05，故采用Kruskal-Wallis方法进行秩和检验。结果显示，连翘苷组P = 5.677e-5＜0.001，连翘酯苷组P =6.196e-5＜0.001，均提示不同炮制组的2种指标成分含量均数不相等或不全相等。随后采用Wilcoxon方法进行样本间的两两比较，发现蒸汽与水煮方式对连翘苷含量影响无统计学意义（P = 0.969 5＞0.05），而生晒组与蒸汽组（P = 0.000 2＜0.001）、水煮组（P =0.000 2＜0.001）差别均有统计学意义；同样，蒸汽与水煮加工方式对连翘酯苷A含量影响无统计学意义（P = 0.853 4＞0.05），生晒与蒸汽处理组（P = 1.083e-5＜0.001）、水煮组（P = 1.083e-5＜0.001）差别均有统计学意义。

3 讨论

本实验采集连翘道地产区青翘样品共10组，经蒸汽、水煮及生晒方式进行加工后检测其2种指标性成分的含量，发现生晒组连翘苷含量均低于2015版《药典》[1]标准，而其余各组结果均优于该标准。针对样品进样前的稀释倍数，分别考察了稀释10倍，100倍，1 000倍3个不同的稀释倍数，发现蒸汽杀青组和水煮杀青组稀释10倍时，连翘酯苷A峰面积明显超出标曲范围，而稀释1 000倍时，连翘苷已无吸收峰，所以，以稀释100倍的样品溶液进样，同时考察了生晒组的适宜稀释倍数，最终确定为稀释10倍。白吉庆等[15]通过正交实验方法，研究得出：青翘以4倍量水煮制10 min，其连翘苷及连翘酯苷A含量高于蒸汽杀青组。本实验重点考察蒸汽、水煮组与生晒组对品质差异的影响，蒸汽杀青采用陵川县连翘加工企业经验方法，水煮杀青采用山西大学姜涛[13]的研究方法。就连翘苷含量而言，蒸汽及水煮杀青后，2组含量经统计学分析，差异无统计学意义，且含量范围为0.59%～0.79%，达到《药典》最低限量标准4倍以上。考察连翘酯苷A含量，3种处理方法均达到《药典》标准，但生晒组含量明显低于蒸汽和水煮杀青组且差异有统计学意义；蒸汽和水煮组差异无统计学意义。该研究结果提示，作为传统产地和加工地，山西陵川县及周边河南辉县的连翘品质可靠；蒸汽和水煮处理青翘以杀酶保苷，对于保证和控制药材质量较生晒方式优势明显。《药典》规定青翘以蒸制方式处理，但根据本研究结果，在条件不具备的地区，可以考虑以水煮方式进行产地加工；当然，水煮对于连翘中其他药效成分有无不利影响，有待进一步研究。生晒过程中，由于干燥温度相对较低，有效成分可能在酶的作用下发生降解，从而使其有效成分含量大幅降低；而蒸汽和水煮处理时的高温可使酶在短时间内灭活而起到良好的保苷作用。水煮往往使部分有效物质溶出而降低其含量，青翘外果皮包被的角质层可能在较短时间内（水煮时间为8 min）对于物质溶出起有效的阻碍作用，使得本加工方式与蒸汽组的有效成分含量无明显差异。明确蒸汽和水煮方式在保证连翘苷和连翘酯苷A含量方面优于传统生晒方法，对于控制连翘药材质量和指导产地加工具有一定的借鉴意义。

：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典: 1部[M].北京:中国医药科技出版社, 2015:170-171.

[2]吴国友.连翘药理作用研究进展[J].中医学报, 2013,28(10):1508-1509.

[3]张天锡,史磊,刘雯,等.连翘化学成分、药理活性现代研究[J].辽宁中医药大学学报, 2016, 18(12):222-224.

[4]中国植物志编委会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1992:42.

[5]吴婷,魏珊,米丽华,等.不同产地连翘的DNA指纹图谱构建与聚类分析[J].中草药, 2016, 47(5):816-820.

[6]魏珊,吴婷,李敏,等.不同产地连翘挥发油主要成分分析及抗菌活性研究[J].中国实验方剂学杂志, 2016, 22(4):69-74.

[7]梁军,郭信东,夏永刚,等. UPLC同时测定不同产地连翘中8种成分[J].中国实验方剂学杂志, 2017, 23(11):68-72.

[8]崔旭盛,李鑫,王伟,等.连翘适宜采收期研究[J].安徽农业科学, 2017, 45(11):107-108, 137.

[9]原江锋,邱智军,刘建利,等.河南和山西连翘叶中总木脂素、连翘酯苷A、连翘酯苷B和连翘苷的含量比较[J].天然产物研究与开发, 2015, 27(5):845-848, 864.

[10]孙娥,徐凤娟,张振海,等.中药炮制机制研究进展及研究思路探讨[J].中国中药杂志, 2014, 39(3):363-369.

[11]付鹏亮,王东强,李志军.连翘酯苷药理作用研究进展[J].长春中医药大学学报, 2011, 27(6):1062-1063.

[12]李杨,周福军,单淇,等.连翘提取物含量测定及其对脓毒症大鼠死亡率的影响[J].长春中医药大学学报, 2013,29(3):387-390.

[13]姜涛.连翘炮制方法及过程规范化研究[D].太原:山西大学, 2013.

[14]R CORE TEAM. R. A language and environment for statistical computing[M]. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2015(1):12-21.

[15]白吉庆,王小平,曹林林,等.产地加工方法对青翘中连翘苷,连翘酯苷A的影响[J].中国中药杂志, 2011,36(23):3258-3261.