人参蛋白的提取和体外免疫调节活性研究

王钰莹，闫福源，闫凯丽，王任晶，许 宁，王丹阳，汪 莹，何慧楠，刘 莉

（长春中医药大学药学院，长春 130117）

人参为五加科植物人参（Panax ginseng C. A.Meyer.）的干燥根及根茎。人参被人们视为百草之王，具有大补元气、补脾益肺、生津止渴等功效[1]。人参具有多种化学成分，主要包括皂苷类、挥发油类、氨基酸类、脂肪酸类、糖类、蛋白质及多肽、无机盐类等[2-6]。现代药理学研究[7-9]表明，人参具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血糖等活性，并对其他药理活性起着协同调节作用。人参皂苷被认为是人参的主要活性成分，近年来的研究[10-13]表明，人参多糖，人参蛋白等大分子也具有明显的生物活性。本研究针对人参当中的大分子物质蛋白质进行提取和性质检测，并以小鼠巨噬细胞为研究对象，对人参蛋白体外的免疫调剂活性进行初步的探索研究，为把人参蛋白开发成保健食品的原料提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 DMEM培养基，购于Gibco公司；MTT（噻唑蓝），购于Thiazoly公司；DMSO，国药集团化学试剂北京有限公司；PGE2酶联免疫测定试剂盒、TNF-α酶联免疫测定试剂盒，购自上海朗顿生物科技有限公司；脂多糖（LPS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS） 均购于 Sigma 公司；Infinite 200 Pro型酶联免疫检测仪，购自瑞士TECAN公司，3111型CO2培养箱购自Thermo Forma公司。

1.2 细胞株 小鼠巨噬细胞样细胞株 RAW 264.7（ATCCTIB-71），购自武汉普诺赛生物技术公司。

1.3 实验方法

1.3.1 人参蛋白的提取 称洗净鲜人参500 g，加入浓度为0.01 mol/L，pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液5 000 mL，匀浆，4 ℃ 浸提，每隔1 h用0.01 mol/L的Tris溶液调节pH至中性，浸提12 h后，用绢布过滤浸提液，滤渣加入5 000 mL Tris-HCl缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）4 ℃浸提12 h，用两层绢布过滤浸提液，合并浸提液，4 000 r/min离心20 min，收集上清。用中空纤维膜过滤系统超滤（0.45 μm）和微滤（MW 10 000）浸提液，收集大分子滤液，向滤液中缓慢加入(NH4)2SO4，使饱和度达到75%，4 ℃沉淀12 h后，4 000 r/min离心20 min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解，透析（MW 8 000），冻干，即得人参总蛋白（GP）。

1.3.2 人参蛋白的含量测定 采用lowry法测定蛋白含量，按照试剂盒使用说明书测定人参蛋白的含量。

1.3.3 人参蛋白分子量分布测定 采用SDS-PAGE电泳测定人参蛋白的亚基分子量分布。

1.3.4 细胞毒性实验 在RAW 264.7细胞培养3代生长状态稳定后，将RAW 264.7细胞制成细胞悬液，用血球计数板计算细胞悬液中细胞个数，使其细胞密度为2×105个/mL，铺于96孔板，每孔100 μL。适宜条件下培养。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20 μL，分别是 50、100、200 μg/mL，补加培养基至100 μL，平行设6组，空白组以同体积无菌PBS代替，阳性对照组加入同体积20 μg/mL LPS，培养24 h。用MTT法检测细胞存活率：加入浓度为5 mg/mL的MTT 20 μL，继续置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养4 h，将培养基吸出，加入180 μL DMSO，振摇10 min，在波长490 nm处，测定OD值。

1.3.5 NO含量检测 将细胞密度为1×106个/mL的细胞液接种于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2的培养箱中培养6 h。参照NO含量测定试剂盒说明，振摇10 min，在波长490 nm处，测定OD值，根据标准孔绘制出亚硝酸浓度与光度值的标准曲线，并计算样品孔NO浓度。

1.3.6 PGE2、TNF-α含量检测 细胞培养液中PGE2的测定参照酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒说明，细胞悬液在10 000 r/min、4 ℃下离心10 min，吸取上清20 μL进行酶联免疫吸附反应，在450 nm测定吸光度值（OD值），计算PGE2含量。 细胞培养液中TNF-α的测定参照酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒说明，细胞悬液在10 000 r/min、4 ℃下离心10 min，吸取上清20 μL进行酶联免疫吸附反应，在450 nm测定吸光度值（OD值），计算TNF-α含量。

1.4 统计学方法 数据均以均数±标准差（）表示。t 检验采用SPSS 19.0软件完成，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参蛋白的蛋白含量和分子量分布 采用lowry法测定人参蛋白的蛋白含量为1.95 mg/mL，人参蛋白的亚基分子量从8 kD 到 66 kD，其中分子量为28 kDa的和26 kDa的蛋白含量最高。

2.2 人参蛋白对RAW264.7细胞活性的影响 见图1。细胞吞噬能力与样品浓度呈量效关系。结果表明，人参蛋白具有增强细胞吞噬能力的作用（P＜0.01）。

图1 人参蛋白对RAW 264.7细胞活性的影响

2.3 人参蛋白对RAW 264.7细胞释放NO的影响 测定NO含量所得标准曲线为Y = 0.013 2 X+0.106 9，R2=0.999 3。结果空白组产生NO最少，阳性对照组分泌的NO含量最高，给药浓度增加，细胞分泌的NO含量也增加。实验组与空白组相比均有统计学意义（P＜0.01），且各实验组NO浓度均低于阳性对照组。

2.4 人参蛋白对RAW 264.7细胞分泌PGE2、TNF-α的影响 见图2。

如图2所示，与空白组相比，给药组细胞分泌的PGE2较多。人参蛋白可以促进巨噬细胞分泌PGE2，使其上清中PGE2含量增加，和空白组对比差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图2 人参蛋白对RAW 264.7细胞分泌PGE2、TNF-α的影响

实验所配置的药物浓度均能使细胞分泌TNF-α的含量增加，与空白组比较，P＜0.01，药物浓度最大时，细胞分泌TNF-α含量最高。各组TNF-α分泌量相比，阳性对照组含量最高，说明人参蛋白促进细胞分泌TNF-α的同时，对细胞作用温和。

3 讨论

近年来，有文献[14]表明，人参可以提高淋巴细胞的增殖能力，说明人参具有免疫增强的作用。本实验研究从人参中提取的人参蛋白对巨噬细胞的免疫调节作用，实验结果表明，巨噬细胞经过人参蛋白作用后，释放NO含量，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和前列腺素E2（PGE2）的含量增加，并且对细胞无毒性。当人参蛋白浓度较大的时候，作用较为显著且温和。人参蛋白可以提高巨噬细胞的免疫功能，其中的作用机制可以进一步研究。本研究表明不同浓度的人参蛋白作用于RAW 264.7细胞，细胞NO分泌增多，说明人参蛋白可通过上调限制酶iNOS的表达来促进NO分泌，增强巨噬细胞杀死病原微生物的能力[15-16]。

巨噬细胞还有免疫递呈的作用。巨噬细胞免疫递呈作用是通过释放PGE2、TNF-α等免疫因子来实现的，这些免疫因子刺激T/B细胞，实现免疫级联反应。本研究表明，不同浓度的人参蛋白可促进细胞释放PGE2、TNF-α。

由上述结果可知，人参中的人参蛋白能够增强巨噬细胞的免疫活性，可以从释放免疫因子等方面增强免疫活性。人参可以作为增强免疫力保健品的原材料。

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