淫羊藿苷对BALB/c-nu裸小鼠雄激素依赖性前列腺癌雄激素受体信号转导通路的影响

陈少秀，饶 红，陈德森

（1.十堰市太和医院，湖 北 十堰 442000；2.湖北医药学院基础医学院， 湖北 十堰 442000）

淫羊藿别名短角淫羊藿，性温、味辛甘，走肝肾二经，为强筋骨、益精气、补肾壮阳、补命门及祛风除湿之要药[1-2]。其主要成分为淫羊藿苷，目前研究[3-4]认为，淫羊藿苷抗肿瘤机制多与其影响肿瘤细胞相关的信号转导通路及相关因子表达有关。前列腺癌为前列腺腺泡细胞基因突变引发的前列腺恶性肿瘤，多发于中老年男性，对其积极防治可降低发病率、提高生存率。在前列腺腺泡细胞基因突变及癌变过程中，P13K/Akt通路及相关因子与前列腺腺泡癌变细胞凋亡及增殖等方面发挥重要作用[5]。目前，对单体淫羊藿苷的研究[6]已证实，其对前列腺腺泡癌变细胞具有抑制细胞周期、降低细胞侵袭力及转移等作用。但其抑癌抗癌是否是通过影响P13K/ Akt信号转导通路及相关因子表达的活体动物实验却缺乏相关报道，本实验系统观察了淫羊藿苷对BALB/c-nu裸小鼠P13K/Akt信号转导通路及相关因子表达的影响，为其可能用于临床治疗雄激素依赖性前列腺癌提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SPF级BALB/c-nu裸小鼠，雄性，40只，体质量（20.50±1.50）g，采用随机数字表编号后随机均分为对照组、模型组、抑制剂组和实验组（n =10只）。动物由湖北医药学院实验动物中心提供，SYXK（鄂）2017-0031。

1.2 药品及试剂 淫羊藿苷，成都瑞芬思生物科技有限公司；人 LNCaP前列腺癌细胞株，基尔顿生物科技（上海）有限公司；p-Akt、p-AR、AR-V7、E-cadherin及Calcitonin等检测用Elisa试剂盒，均购自北京绿源伯德生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LNCaP裸小鼠模型建立 将模型组、抑制剂组和实验组共30只BALB/c-nu裸小鼠用乙醚吸入麻醉后仰卧位固定于无菌台，手术在无菌屏蔽室进行，消毒下腹部皮肤，延腹白线切开皮和腹直肌并分离腹膜，用玻璃分针将膀胱推向尾端，使之翻转，暴露裸小鼠生殖腺并用医用脱脂棉签推向左右腹壁以充分暴露裸小鼠左右叶前列腺腺体。然后抽取调制好的人LNCaP前列腺癌细胞株（约2×107个/mL）50 µL，于左右两叶前列腺内精确注射25 µL，还纳生殖腺并逐层缝合，消毒，2周后即可建立LNCaP裸小鼠模型[7]。对照组注射等体积生理盐水对照。

1.3.2 治疗方法 在注射人LNCaP前列腺癌细胞株28 d 时，4组均采用尾静脉注射给予相关药物治疗28 d（1次/d）。实验组尾静脉注射给予100 µL淫羊藿苷80 mg/kg，抑制剂组给予100 µL P13K/ Akt抑制剂LY294002，对照组、模型组给予等体积生理盐水（100 µL）尾静脉注射对照。

1.3.3 检测指标及方法 采用Western blotting法检测前列腺癌变组织雄激素受体剪接变异体7（AR-V7）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）和磷酸化雄激素受体（p-AR）蛋白表达； FITC-CY3法检测钙黏蛋白E（E-cadherin）和降钙素（Calcitonin）阳性率。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。数据以均数±标准差（）表示，计量资料数据先进行正态分布及方差齐性检验，符合正态分布的组间差异采用配对资料 t检验，方差不齐时采用校正t检验，率的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组治疗28 d后p-AR和p-Akt检测结果比较 见表1。

表1 4组治疗28 d后p-AR和p-Akt检测结果比较（ ，n = 10）

表1 4组治疗28 d后p-AR和p-Akt检测结果比较（ ，n = 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别 p-AR p-Akt对照组 0.69±0.04 0.92±0.11模型组 3.16±0.17# 1.87±0.14#抑制剂组 0.65±0.06△ 0.90±0.09 △实验组 0.67±0.08△ 0.89±0.07 △

2.2 4组治疗28 d后Calctionin、E-cadheri和AR-V7检测结果比较 见表2。

表2 4组治疗28 d后Calctionin、E-cadheri和AR-V7检测结果比较（ ，n = 10） %

表2 4组治疗28 d后Calctionin、E-cadheri和AR-V7检测结果比较（ ，n = 10） %

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别 Calctionin E-cadherin AR-V7对照组 30.87±4.13 82.59±7.35 19.38±2.54模型组 46.15±5.24 # 23.46±1.73# 33.46±4.02 #抑制剂组 29.94±3.04△ 81.25±7.51△ 17.72±2.19△实验组 31.03±2.85△ 80.34±6.97△ 19.26±1.94△

3 讨论

P13K/Akt信号转导通路途径作为介导细胞生长、存活、抑制细胞凋亡及促进细胞增殖的经典信号转导通路之一，与前列腺腺泡细胞基因突变引发的前列腺恶性肿瘤密切相关[8]。AR为核内转录因子，为雄激素受体，当AR与雄激素结合后可激活下游靶基因，正常生理状态下对维持前列腺祖细胞正常分化起调节作用[9]。Akt即蛋白激酶B，是P13K/Akt信号转导通路中重要的蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用[10]。研究[11]发现，AR和Akt表达增强可激活P13K/Akt信号转导通路。而激活后的P13K/Akt信号转导通路会促进两者发生磷酸化反应，生成p-Akt和p-AR，从而抑制细胞凋亡，且p-AR可促进AR向胞核转移，加速肿瘤细胞的分化和转移[12]。在P13K/Akt信号转导通路相关的因子中，AR-V7作为AR的剪接变异体不依赖雄激素即可持续激活AR进入胞核并激活P13K/Akt信号转导通路而发挥促前列腺腺泡细胞基因突变及癌变的生物学效应[13]。E-cadherin和Calctionin在前列腺癌的发生和发展中均发挥着重要作用，前者属钙黏附蛋白，具有增强肿瘤细胞与间质细胞黏附力的作用，与肿瘤细胞浸润和转移有关，E-cadherin高表达不利于肿瘤细胞浸润和转移[14]。后者由前列腺组织中的神经内分泌细胞分泌，其高表达会促进前列腺癌产生去势抵抗[15]。

本实验抑制剂组中使用的LY294002为P13K/Akt信号转导通路抑制剂，能有效抑制LNCaP生长，降低其侵袭、转移能力[16]。实验观察到其对P13K/Akt信号转导途径具有明显的抑制作用，而采用淫羊藿苷治疗的实验组的作用与抑制剂组作用基本相同，也可降低p-Akt及p-AR蛋白表达，降低Calctionin及AR-V7的阳性率，提高E-cadherin的阳性率，这一结果提示淫羊藿苷对P13K/ Akt信号转导通路途径中的作用靶点与LY294002相同。研究[17]表明，E-cadherin增高可增加肿瘤细胞与基质之间的黏附力，阻止肿瘤细胞转移，Calctionin降低可减少去势抵抗，两者共同作用可降低肿瘤细胞的侵袭能力。本实验提示，淫羊藿苷除对P13K/Akt信号转导通路途径产生调节作用外，还可通过影响E-cadherin和Calctionin这一途径影响LNCaP侵袭和转移。

综上所述，淫羊藿苷对P13K/Akt信号转导通路的作用可能主要是阻止Akt、AR的磷酸化过程，同是还能通过提高E-cadherin以增加肿瘤细胞与基质之间的黏附力，降低Calctionin以减少去势抵抗现象，从而实现抑制LNCaP细胞侵袭和转移，为研发淫羊藿苷可能用于治疗原发性前列腺癌提供了实验及理论依据。

：

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 淫羊藿[M] .中国植物志,北京,科学出版社, 2001:296.

[2]王文龙,顾雪竹,李雪婷,等.淫羊藿提取工艺优化研究[J].长春中医药大学学报, 2011, 27(2):163-164.

[3]蒋凌云,刘光明,陈可欣.淫羊藿苷的提取、分离和抗肿瘤作用机制的研究进展[J].现代药物与临床, 2011,26(5):353-358.

[4]张黎声,韩小晶,罗志荣,等.淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞迁移作用的影响[J].中国中医药信息杂志, 2017,24(2):44-48.

[5]张扬,吴朝蒙,雷博涵,等.PI3K/AKT/FOXO1信号通路参与复方中药CFF-1诱导的前列腺癌细胞凋亡和周期阻滞[J].中华男科学杂志, 2017, 23(9):828-837.

[6]张温花,张文超,于远东.淫羊藿苷对前列腺癌细胞株活力、迁移与侵袭的作用[J].中国病理生理杂志, 2017, 33(6):1017.

[7]王金秋,李志,何丹,等. SCID小鼠原位接种LNCaP前列腺癌模型的建立[J].北京农业职业学院学报, 2012, 26(5):19.

[8]宋竖旗,张亚强,薄海.前列消癥汤对前列腺癌PC-3细胞PI3K/Akt信号通路表达的影响[J].中国中医基础医学杂志,2014, 7(4):455-458.

[9]SHIOTA M, YOKOMIZO A, MASUBUCHI D, et al. Tip60 promotes prostate cancer cell proliferation by translocation of androgen receptor intothe nucleus[J]. Prostate, 2010,70(5):540-554.

[10]DEHM S M, TINDALL D J. Molecular regulation of androgen action in prostate cancer[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2006, 99(2):333-344.

[11]黄海,何旺,赖义明,等. PSMA激活PI3K/Akt通路对前列腺癌细胞增殖与凋亡及迁移能力的影响[J].中山大学学报(医学科学版), 2016, 37(4):490-496.

[12]匡小跟,张晖辉,许韩峰,等.钙黏蛋白E,桥粒芯糖蛋白2,磷酸化Akt和转录因子Snail在侵袭性前列腺癌中的作用[J].中国现代医学杂志, 2016, 26(8):38-42.

[13]瞿元元,叶定伟,戴波,等.前列腺癌组织中雄激素受体剪接变异体7的表达对转移性前列腺癌患者总生存的影响[J].中华外科杂志, 2014, 52(8):622-626.

[14]房前,杜文亮,王军起,等.转染tbx2 siRNA对人前列腺癌细胞增殖,迁移,侵袭及上皮-间质转化的影响[J].山东医药, 2017, 57(23):35-38.

[15]陈放知,赵晓昆.前列腺癌的去势抵抗机制[J].中南大学学报(医学版), 2017, 42(10):1217-1221.

[16]王永清,林艳,赵俊夺,等. LY294002对多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制作用及机制研究[J].中国实验血液学杂志,2017, 25(4):1092-1096.

[17]赖丽娟,谢佳丽,黄志华.淫羊藿素的抗肿瘤作用及机制研究进展[J].中药药理与临床, 2016, 68(6):235-238.