鸡人工感染弓形虫病的组织学病理变化

李静静

(庆阳市庆城县动物疫病预防控制中心，甘肃 庆阳 745100)

弓形虫病是由刚第弓形虫引起的一种严重危害人类健康的人兽共患原虫病。该病在世界各地流行非常广泛，在畜牧业行业中，弓形虫的危害作用日益显著，造成的经济损失日益增长，对畜禽健康生长造成较严重的制约。通常单一的感染不能引起明显的临床症状，但是一旦继发感染，可造成严重后果，患病动物死亡率会大大增加，可造成严重的经济损失。该病的感染源主要是病畜和带虫动物。猫及猫科动物是弓形虫的终末宿主。其中被终末宿主猫排出的卵囊污染的饲料、饮水或事具均可成为家畜感染的重要来源。畜禽和多种野生动物对弓形虫均具有感染性，其中包括 200多种哺乳动物、70多种鸟类、5种变温动物和一些节肢动物。一般以经口感染为主，也可经破损的皮肤和粘膜感染。家畜弓形虫病一年四季均可发，但一般以夏秋季居多。

弓形虫只有单一虫种，但同一虫株对不同宿主的敏感性、致病性差异较大，有滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊5种主要形态，需要两个宿主，经历无性生殖和有性生殖两个生殖过程。前两种虫体形态主要存在于中间宿主体内，后三种虫体主要出现在终末宿主体内。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 切片机、摊片机、烘片机、显微镜等。

1.1.2 主要试剂 10%福尔马林溶液、75%酒精、80%酒精、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、 100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ、5%的酸化液、苏木素染液、酸水分化、伊红染液、中性树胶等。

1.2 方法

1.2.1 切片操作 进行石蜡的切片及HE染色，显微镜下观察脾脏、肝脏、肾脏的病理学变化。

1.2.2 感染方法 病料人工经口感染弓形虫病的鸡的脾脏、肝脏和肾脏。

2 石蜡切片，HE染色

2.1 石蜡切片

2.1.1 取材 用取材器轻轻地取脾脏、肝脏、肾脏的小块组织为组织块，不用力牵引，不再组织上来回拖拉，以免造成组织的结构损伤。①样品要求：长，宽各1 cm左右，厚不得超过5 cm。②固定液：10%福尔马林固定液：组织块=20∶1。③固定时间：3～5 h，密封瓶口，封前换液。④修块：顺着组织方向，将切面修平，标记，编号，用纱布包好，用于下步脱水固定。

2.1.2 脱水过程 ①水洗，将固定组织块放入广口瓶，瓶口用纱布包好，置流水下水洗，水洗时间为12 h 。②脱水，经过固定后的组织块冲洗后进行脱水，脱水的目的是将组织内的水分用酒精置换出来，使组织变硬，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。脱水的顺序依次是：75%酒精 → 80%酒精→95%酒精Ⅰ→95%酒精Ⅱ→100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ。脱水时间为各1h。③透明，透明是切片前必经之步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙内。经过透明剂处理的组织块用肉眼观察呈透明现象，因此将这个过程称为透明。透明的顺序依次是：酒精(100%)；二甲苯=1∶1 → 二甲苯Ⅰ→ 二甲苯Ⅱ→透明时间为各10 min。

2.1.4 浸蜡 浸蜡是将包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中，然后将这种物质凝固，从而将组织材料包埋其中的方法。浸蜡顺序依次是：二甲苯∶石蜡=1∶1 →石蜡Ⅰ→石蜡Ⅱ→ 石蜡Ⅲ 。浸蜡的时间：二甲苯∶石蜡=1∶1为30 min，石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ的时间各1 h。浸蜡时温箱的温度应保持在56～58℃。

2.1.5 包埋 包埋首先在金属框架上涂抹凡士林，以保证石蜡倒入后不会外溢。将包埋用石蜡及浸蜡组织块放在有石棉网的电炉上保温。在框架中先倒入少许包埋用石蜡，再用镊子将组织块迅速移入框架，再倒入石蜡，待完全凝固后取出待用。

2.1.6 修蜡 取已包埋好的蜡块，用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去，把有组织的蜡块修成正方形或梯形，用于切片。

2.1.7 切片及展片 将修好的蜡块固定于切片机上，调好距离和厚度，然后右手摇动手柄切成5～8 μm薄片,切下的薄片用毛笔挑取放到加热的水中展平，以便附贴。

2.1.8 附贴及烘片 将涂有附贴液(鸡蛋清)的载玻片在展片池中捞取一展平的切片，放到烘片机上烘干，烘片机温度应保持在40～45℃之间，烘片时间为1 h。

2.2 染色

2.2.1 脱蜡 脱蜡的顺序依次为 二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→ 100%酒精Ⅰ→ 100%酒精Ⅱ→ 95%酒精Ⅰ→ 95%酒精Ⅱ→ 80%酒精→自来水水洗。脱蜡的时间：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡各10 min，100%酒精Ⅰ脱二甲苯10 min，100%酒精Ⅱ、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、80%酒精脱二甲苯各5 min，自来水去酒精5 min。

2.2.2 染色 染色的顺序依次为5%的酸化液 →苏木素染液→冲洗→酸水分化→冲洗→伊红染液。染色时间： 5%的酸化液为5 s，苏木素染液为细胞核着色5 min，清水冲洗15 min，酸水分化液 (75%的酒精加500 mL的盐酸就是0.5%的盐酸酒精)10～20 s ，清水冲洗为淡蓝色大概20 min即可，伊红染液为细胞质着色，一般为3 min。

2.2.3 脱水 脱水顺序依次为 80%酒精→95%酒精Ⅰ→ 95%酒精Ⅱ → 100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ →二甲苯Ⅰ → 二甲苯Ⅱ 。 80%酒精颜色淡化5 min， 95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、100%酒精Ⅰ各5 min，100%酒精Ⅱ10 min ，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明时间分别为5 min、10 min。

2.2.4 封片及烤片 取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近中间滴有中性树胶的载玻片，然后迅速放下盖玻片，中性树胶会迅速扩张到四周，校正好盖玻片方向。将封好的切片放置在45℃烘片机上烘烤一夜。

3 结果

3.1 剖检眼观病理变化

脾脏稍肿并且有散在出血点。肝脏肿大，其表面散在粟粒大的出血点。肾脏苍白，略肿，被膜下散在小出血点。

3.2 镜检结果

3.2.1 脾脏的病理学变化 脾脏充血出血(详见图1)，水肿，脾窦含血量增多，红髓中可见坏死灶。被膜及小梁因平滑肌细胞水肿而略增厚，在有核细胞内发现大量弓形虫滋养体，他们有的呈月芽状或弓形，有的呈柠檬状，圆形，椭圆形等多样形状。许多滋养体簇集在1个细胞内形成假囊，在一视野里平均可找1个假囊(详见图2)。脾细胞大量坏死，有的已破裂崩解，滋养体从中逸出，有的细胞内充满了滋养体。细胞核已消失。此外脾组织内充满红细胞，呈出血性坏死性炎症。血液细胞内的白细胞被滋养体破坏。

3.2.2 肝脏的病理学变化 肝细胞大量坏死，有的已破裂崩解，滋养体从中逸出，有的细胞内充满了滋养体。细胞核已消失。此外肝组织内充满了红细胞，呈出血性坏死性炎症，肝组织间隙内有大量嗜酸性细胞浸润，血液细胞内的白细胞被滋养体破坏。中央静脉充血出血(详见图3)，肝细胞发生颗粒变性和空泡变性，间质细胞增生(详见图4)。

3.2.3 肾脏的病理学变化 肾小球充血出血(详见图5)，水肿，肾小管浆液性渗出(详见图6)，在部分肾间质有嗜酸性粒细胞浸润，其间质细胞发生坏死。肾小管上皮细胞颗粒变性和空泡变性(详见图7)。

图3 肝脏中央静脉充血出血。(HE，×400) 图4 肝脏内滋养体崩解。(HE，×400)

图7 箭头所指为肾小管上皮细胞充血，水肿，浆液渗出。(HE，×400)

4 结论

本实验结果得出鸡人工经口感染弓形虫病病原体后，剖检病变和组织学病理变化最明显的皆是脾脏、肝脏、肾脏，病理变化发现其有严重的充血出血，水肿。镜检发现在有核细胞内发现大量弓形虫滋养体，它们有的呈月芽状或弓形，有的呈柠檬状，圆形，椭圆形等多样形状。许多滋养体簇集在1个细胞内形成假囊，在一视野里平均可找1个假囊。肝脾细胞大量坏死，有的已破裂崩解，滋养体从中逸出，有的细胞内充满了滋养体。细胞核已消失。此外肝脏、脾脏组织内充满红细胞呈出血性坏死性炎症血液细胞内的白细胞被滋养体破坏。由此得出弓形虫病对鸡的养殖和人类健康存在很大的威胁，需引起人类重视。尤其在粗放型养鸡场中，必须加强鸡场的卫生防护以保护养鸡业发展和人类健康。

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