提高保乳手术冷冻切片质量的技术探讨

董芸蓉

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，治疗主要采用外科手术的方式。早期乳腺癌实施保乳手术可有效减少患者的痛苦，提高生活质量，减少手术并发症，且能获得与改良根治术相同的长期生存率，故保乳手术日益得到临床与广大患者的青睐。术中快速冷冻病理诊断在保乳手术中对确定肿块的性质，明确切缘的状况及前哨淋巴结有无转移起着至关重要的作用，继而为临床医师决定手术方案提供可靠的依据。本文通过回顾性分析，探讨如何提高保乳手术冷冻切片的质量。现报道如下。

1　资料与方法

1.1材料 选取2017年1－6月宁波市临床病理诊断中心术中送检保乳手术标本（包括前哨淋巴结、肿块、切缘）80例，对其进行回顾性研究总结。

1.2仪器及试剂 ThermoCryotomeFSE冷冻切片机，Leica819刀片，包埋剂（普通胶水），固定液（甲醇），梯度乙醇，二甲苯，Baso苏木精染液，Baso醇溶性伊红染液，均购置珠海贝索生物技术有限公司。

1.3方法 切片机速冻台温度设置在－40℃左右，箱体及冻头温度设置在－15℃左右，具体根据组织类型不同作适当调节。送检组织规范取材后，用吸水纸将组织表面的血性液体吸干，在预冷的标本托上涂少量包埋剂，待包埋剂底部变白即放入组织，加盖少量包埋剂，轻轻压上速冻锤，待组织能与速冻锤分开后即可进行切片。将标本托固定在切片机的冻头上，先利用冷冻箱左侧的快进退键按钮使组织块恰好位于切片刀的后方，先进行粗修，暴露至组织最大面，即可进行细修切片。良好的切片便在防卷板下方形成一张完整平坦且无皱褶的薄片，若切片略有弯曲可用小毛笔轻轻展平切片，打开放卷板，用载玻片平稳地轻压组织，使其平整地吸附到载玻片上[1]，贴片完成后立即入固定液中固定1 m in，行常规HE染色。

2　结果

切片完整，厚薄均匀，无皱褶及裂痕，组织结构清晰，无冰晶形成，染色鲜艳，核质分明，脱水透明洁净，封裱美观（图1～ 2）。

3　讨论

冷冻切片是指新鲜组织不经任何固定脱水等处理，直接在低温恒冷切片机冷冻后马上进行切片的一种技术[2]，其目的是在短时间内作出准确的病理诊断，而切片质量的保证，除组织规范取材外，与组织的速冻包埋、切片的温度、切片的技巧及染色等因素是密不可分的。

3.1取材 送检标本必须新鲜无固定，取材时应务必保持取材台面及取材器械的干燥，严禁用流水冲洗标本，如遇水时，用干纱布或吸水纸将组织吸干，以免产生冰晶。（1）前哨淋巴结：淋巴结最大径＞0.5 cm，则应剖开取材，同时应尽量将其周围无诊断意义的脂肪组织剔除干净，因脂肪组织的冷冻温度低于淋巴结组织，两者的冷冻时间不一致，当淋巴结组织冻好时，脂肪组织还未冻上，导致切片时被膜不完整。（2）肿块：取材大小应以 1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm 为佳，平整，厚薄均匀，病变不够典型时可适当增加取材，夹杂在肿块中间的脂肪组织无法剔除，肿块周围的脂肪组织也应尽量剔除干净。（3）切缘：应根据临床医师标记进行取材，为防止标本差错，用不同颜色的标本托区分各方向切缘。

3.2速冻及包埋 速冻是影响冷冻切片质量最关键的因素，组织若不是在最短时间内冷冻，就易产生冰晶。冰晶就是缓慢冷冻使细胞内的水分子向细胞间疏松区域游离、聚集，然后凝结成冰。冰晶会把组织或细胞间隙扩大，等片子快速放入固定液后，冰融化成水，周围组织收缩，引起组织结构变形并留下了大量空洞。因此，只有快速冷冻，才能在细胞内水分子还没有游离出细胞前即凝结成冰，使胞浆内的有形物质基本上保持在原位[3]。标本托上的包埋剂应尽量少放，包埋剂太多会影响冷冻的速度，继而产生冰晶。淋巴结及切缘组织过小或过薄时，可将包埋剂先滴加在标本托上，制作一个冰托，再将组织放在上面进行包埋。对于含脂肪组织较多的切缘组织，由于脂肪组织本身结构的特殊性，其被疏松结缔组织分割成脂肪小叶，脂肪小叶由大量群集的脂肪细胞构成，脂肪细胞中含有大量脂滴，很难被冻硬，可将它们放在吸水纸间，用手指轻压，把脂滴挤出后再进行包埋。

图1　乳腺癌，组织结构清晰，核质分明，染色鲜艳（HE，×100）

图2　前哨淋巴结，组织结构清晰，核质分明，染色鲜艳（HE，×100）

3.3切片 肿块切片时手摇轮用力应均匀、柔和，尽量切取靠近冻锤表面的组织，切出最大面即可，因为修得越深，里面的组织冻得越慢，易产生冰晶。淋巴结组织由于其细胞较丰富，纤维成分少，组织易发脆，切片时容易产生裂痕，切片温度应调节至－12℃左右，切片厚度4 m，若出现裂痕，可用拇指指腹轻按标本使其复温，淋巴结的被膜一定要切全，以免被膜下窦内的微小转移癌漏诊。对于含较多脂肪组织的切缘，将箱体温度调节至－35℃左右，切片厚度15～20 m，切片时应快速进刀，因为刀口的温度低于冷冻组织的温度，若匀速缓慢进刀，会使切片上的脂肪组织变软，使得切片粘连于刀口或自身粘连，不能平整展开而出现皱褶[4]。需指出的是切片时，观察窗不可打开过大，其一防止温度升高影响切片；其二防止散热片及速冻台产生更多的冰霜，影响冷冻系统的效率。

3.4固定 固定可有效抑制组织内各种酶的活性，防止组织自溶和腐败，保持组织与生活时相似的结构和形态[5]。贴片完成后应立即放入固定液中固定1 min，固定若不及时充分，会造成细胞核模糊不清，严重影响诊断质量。固定液选择甲醇，其固定时间快，细胞收缩小，对细胞核和抗原的保存较好[6]。

3.5染色及封片 入Baso苏木精染液染色2 m in，水洗，温水蓝化，入Baso醇溶性伊红染液染色2～3 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。若使用碱性液体蓝化，水洗应充分，否则会造成伊红着色不均，同时二甲苯透明也应充分，防止切片呈云雾状。

综上所述，保乳手术中需要做冷冻切片的标本量大，时间紧，需要对标本进行科学的统筹管理，对各个环节进行质量控制，才能在最短的时间内完成标本的切片及染色，确保病理诊断的准确与及时，为手术保驾护航。