糖尿病肾病患者线粒体结构变化对肾小管病理损伤的影响分析

詹明，张国阳，杨军，余晶波

糖尿病肾病（DN）是引起终末期肾脏病（ESRD）的主要原因，大致占ESRD患者的40%～50%[1]。由于DN发病原因复杂，发病机制尚不完全清楚，临床治疗措施有限，故其发病机制的研究一直是国内外肾脏病领域研究的重点。近年来研究发现，DN肾小管病变并不继发于肾小球，而是其早期和原始特征改变。相当部分糖尿病患者存在肾小管和间质细胞的病理萎缩，而肾小球正常[2]。因此，肾小管细胞损伤是DN发病过程中的一个核心环节。

最新的研究表明，线粒体不仅是细胞内能量工厂，也是高度动态的细胞器，处于不断的融合和分裂中[3]。在糖尿病高糖状态下，在细胞和动物研究中表明肾小管细胞中的线粒体发生一系列形态和超微结构的病理变化，这些变化与肾小管细胞线粒体自噬和氧化应激反应等密切相关，在细胞氧化损伤与细胞凋亡等过程中起着重要作用[4]。然而，有关肾脏细胞线粒体结构变化在临床上对DN患者发病过程中起的作用，尤其是对肾小管损伤的影响和相关性研究，文献报道十分有限。因此，本研究针对DN患者，在临床上观察线粒体结构变化和对肾小管病理改变的影响和作用，以进一步揭示DN的发病机制。现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 收集宁波市第一医院肾脏病理标本库中筛选2014年1月至2016年12月的DN患者并行肾活检确诊的病例共20例（DN组），同时收集微小病变患者并行肾活检确诊的病例共20例作为对照组。

1.2实验方法 收集两组肾活检组织标本行进一步病理检查，通过常规组化染色以观察肾脏病理改变，并比较两组肾脏损伤等级评分。通过透射电镜观察和比较肾小管细胞中线粒体的形态和超微结构，进一步分析DN组肾小管细胞中线粒体结构变化和肾小管损伤的相关性。

将肾活检组织以4%多聚甲醛固定，经乙醇脱水，石蜡包埋，石蜡组织切片及HE、PAS等常规组化染色后，在光镜下行石蜡切片检查。用于电镜的组织标本以2.5%戊二醛固定，经脱水、包埋、超薄切片及染色等制备电镜标本供透射电镜检查。肾脏损伤等级评分采用0～3分的肾脏形态损伤评分系统：没有肾小球/肾小管损伤为0分；25%的肾小球/肾小管损伤为1分；25%～50%的肾小球/肾小管受累为2分；50%及以上的肾小球/肾小管面积受累为3分。

肾活检组织中肾小管细胞线粒体超微结构观察方法采用固定后的肾组织块常规样品制备，超薄切片铅铀双染，透射电镜下观察。选取含线粒体丰富的肾小管上皮细胞，主要观察线粒体融合/分裂的结构变化，线粒体肌丝、肌原纤维、体积和嵴密度及线粒体嵴的超微形态结构变化，并统计发生上述线粒体结构变化的肾小管细胞百分比。

1.3统计方法 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用 检验；采用Pearson分析进行相关性分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组肾脏损伤比较 两组肾小球和肾小管的损伤评分差异均有统计学意义（均＜ 0.05）。见表 1。

2.2肾小管细胞线粒体超微结构观察 对照组微小病变患者肾小管的线粒体呈正常的圆柱状形态，线粒体外膜和内膜结构清晰，嵴分布均匀。其中含正常结构线粒体的肾小管细胞占（80±5）%。而DN组的肾小管细胞中线粒体较对照组出现片段化改变，其中（60±12）%的肾小管细胞出现线粒体的超微结构异常变化，表现为线粒体片段化和圆柱状结构断裂，呈小椭圆形散在分布，质量和体积减少，线粒体基质破坏且出现线粒体嵴溶解和嵴重构。

2.3线粒体结构改变和肾小管病理损伤的相关性分析 进一步将DN组肾组织样本中发生线粒体超微结构变化的肾小管细胞百分比和肾小管病理损伤评分这两个重要参数进行相关性分析，结果显示发生线粒体结构变化的细胞百分比与肾小管损伤评分呈正相关（=0.816＜ 0.05）。

3　讨论

传统观点认为DN主要是肾小球病变，而肾小管的病变较轻微且非特异性。近期的研究发现，肾小管病变也是DN的特征性病理改变，并非继发于肾小球，且是预测疾病进展和预后的重要指标。临床观察证明，51%的I型糖尿病患者存在肾小管细胞萎缩[5]。国内外学者统计发现：在DN的病理改变中，大约1/3的患者无肾小球病变，表现为明显的肾小管细胞和肾间质损害；1/3的患者为肾小球病变；其它1/3的患者则无肾脏结构变化[6-7]。因此，肾小管损伤的研究是阐明DN发病机制的重要研究方向。本研究证实了DN患者的肾组织中肾小球和肾小管均出现了特征性的病理损伤，且损伤评分与对照组微小病变患者比较差异显著，提示肾小管损伤在DN发生发展中的关键作用。

目前，糖尿病患者发生肾小管病理损伤的病因和机制仍不清楚。肾小管上皮细胞在肾脏的重吸收和调节尿液过程中起着关键作用，需消耗大量的ATP酶，为此肾小管富含大量亚细胞器即线粒体以不断供给能量。因而，从线粒体着手是研究肾小管损伤机制的重要途径[8-9]。本研究进一步通过电镜观察发现DN患者的肾小管细胞线粒体发生了显著性结构变化，包括出现线粒体断裂和片段化，线粒体质量和体积减少，线粒体嵴肿胀并伴有嵴溶解等特征性的超微结构变化。且定量分析显示DN组中含异常结构线粒体的肾小管细胞数量是对照组的3倍。此外，本研究的相关性分析显示含异常结构线粒体的肾小管细胞百分比与肾小管损伤评分呈正相关，提示糖尿病环境下线粒体超微结构变化是 DN肾小管病变的一个重要致病因素。结果分析其主要致病原因在于，线粒体的结构决定功能，在糖尿病高糖作用下，肾小管中的线粒体动力学结构发生异常，引起线粒体氧化磷酸化功能障碍，释放过量的活性氧簇，并激活了线粒体凋亡途径，从而引起肾小管细胞氧化损伤和凋亡。因此，在病理上表现为肾小管的萎缩等病变。

表1　两组肾脏损伤评分比较 分

本研究揭示了肾小管细胞线粒体结构变化在DN发病过程中的关键作用，为糖尿病肾小管损伤的发病机制提供了新的临床和实验依据。这一问题的阐明对DN的发病机制和靶向治疗的研究具有重要的临床意义，将为今后开发以线粒体为靶向药物干预治疗来防治DN开辟新的理论和分子“靶点”，为最终有效治疗DN这一日益增长且严重危害人们健康的疾病提供新的思路和策略。