成熟期增生性瘢痕与正常皮肤来源表皮干细胞生物学特性的对比研究

徐永飞 张建文 刘林嶓 周树萍

[摘要]目的：探讨成熟期增生性瘢痕与正常皮肤来源表皮干细胞的生物学特性。方法：选择本院成熟期增生性瘢痕患者病理组织，正常皮肤为本院行游离皮片移植术患者的全厚皮片，分别进行分离培养，获取种子细胞，利用免疫细胞化学技术检测角蛋白19、整合素β1在两组中的表达情况，应用CCK-8检测两组表皮干细胞生长曲线，酶标仪检测两组表皮干细胞450～630nm的吸光度值。结果：角蛋白19及整合素β1在两组中均呈阳性表达，差异无统计学意义（P>0.05）；且两组表皮干细胞具有相似的生长曲线，其不同时间的450～630nm吸光度值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：成熟期增生性瘢痕组织中也存在表皮干细胞，且与正常皮肤来源表皮干细胞具有相近的生物学特性，为整形外科中成熟期增生性瘢痕组织表皮的再利用提供理论基础。

[关键词]增生性瘢痕；表皮干细胞；生物学特性；整形外科；缺损；修复

[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）04-0102-03

Comparative Study of Biological Characteristics of Epidermal Stem Cells from Human Hypertrophic Scar in Mature and Normal Skin

XU Yong-fei1，ZHANG Jian-wen2，LIU Lin-bo2，ZHOU Shu-ping3

（1.Department of Plastic Surgery，Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang 471000，Henan，China；

2.Department of Plastic Surgeny， the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，Henan，China；

3.Department of Microsurgery，NO.153 Central Hospital of the PLA，Zhengzhou 450000，Henan，China）

Abstract： Objective To investigate the biological characteristics of mature epidermal stem cells derived from hypertrophic scars and normal skin. Methods The pathological tissues of patients with mature hypertrophic scar were selected. The normal skin came from the full-thickness skin slices of free skin graft in our hospital. They were isolated and cultured respectively to obtain seed cells. Immunocytochemistry was used to detect the expression of keratin 19 and integrin β1 in both groups. The growth curve of epidermal stem cells and the absorbance of 450～630nm were detected by CCK-8 and microplate reader. Results Keratin 19 and integrin β1 in both groups were positive expression， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. Two groups of epidermal stem cells had similar growth curves， and there were no significant difference in absorbance value between 450 and 630nm at different time（P>0.05）. Conclusion Epidermal stem cells also exist in mature hypertrophic scars， and have similar biological characteristics with normal skin derived epidermal stem cells， which provides a theoretical basis for the reutilization of hypertrophic scar tissue in the orthopedic period.

Key words： hypertrophic scars； epidermal stem cells； biological characteristics； plastic surgery； defect； repair

瘢痕是是創面愈合的最终结果，不仅影响美观，而且常伴畸形及功能障碍，严重影响身心健康，临床上常主张手术治疗[1]，手术原则为彻底切除瘢痕组织，以游离皮片或皮瓣覆盖创面，最大限度的恢复患者外观及功能[2]，但从正常皮肤中获取游离皮片或皮瓣必然会带来新的创伤。瘢痕组织的表皮能否再利用已成为目前讨论的热点[3]。本研究旨在探讨人成熟期增生性瘢痕与人正常皮肤来源表皮干细胞的生物学特性，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验试剂及仪器：PBS液、4%多聚甲醛（UBIO，中国）、无水乙醇、酒精、正丁醇、二甲苯、石蜡、中性树胶；激光扫描共聚焦显微镜、Megafuge离心机、组织包埋机、全自动轮转切片机、全自动轮转切片机、电热鼓风干燥箱、倒置相差显微镜。

1.2 成熟期增生性瘢痕组织：成熟期增生性瘢痕组织来源于2012年7月-2015年7月于本院整形外科行瘢痕切除的20例患者，均经病理证实。其中男12例，女8例；年龄20～75岁，平均46岁；致病原因：烧伤、外伤、手术及皮肤感染等。正常皮肤来源于同期本院行游离皮片移植术的20例患者的全厚皮片，其中男11例，女9例；年龄18～74岁，平均46岁。两组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。纳入标准：①患者6个月内病变组织无破溃、感染及癌变等；②6个月内未口服抗瘢痕药物或激素类药物者；③6个月内未接受放射治疗者；④无精神性疾病及相关器质性疾病。所有患者对本研究知情同意并签署相关知情同意书。

1.3 表皮干细胞的培养及鉴定：将手术获取的瘢痕组织和正常皮肤于无菌环境下带入实验室，均修剪为1.0cm×0.3cm中厚皮片，用PBS液冲洗获取组织，加入DiapaseⅡ，再次用PBS液进行冲洗，过滤上清液并分离获得表皮组织，加入胰蛋白酶进行消化，分散细胞，除去上清液，获取细胞悬液，放置于无菌培养皿中进行培养，并更换KM培养基，并分别加入胰蛋白酶和胶原，再次更换KM培养基，此时分离培养的细胞即为种子细胞。利用免疫细胞化学技术检测表皮干细胞的阳性标记物角蛋白19、整合素β1对两组中是否存在表皮干细胞进行鉴定。角蛋白19阳性表达表现为细胞浆呈红色荧光，整合素β1阳性表现为细胞膜呈红色荧光[4]。

1.4 检测指标：使用酶标仪检测两组表皮干细胞450～630nm的吸光度值，吸光度值越高，表明表皮干细胞增殖能力越强[5]，并连续检测其7d生长曲线。参照Constantine的标准，高倍镜（200×）综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定：按照染色强度（无染色为0分，淡染色为1分，黄色2分，棕褐色3分）和阳性细胞数（在400倍光镜下至少5个视野，细胞阳性数≤1%为0分，1%～10%为1分，10%～20%为2分，≥20%为3分）统计记分，以上两项相加为总分，0分为阴性（-），1～2分为（+），3～4分（++），5～6分为（+++）。

1.5 统计学分析：数据采用SPSS l8.0统计软件进行分析。计量资料采用样本均数t检验进行组间比较，计数资料行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 表皮干细胞鉴定结果：角蛋白19、整合素β1在两组组织中均呈阳性表达，且差异无统计学意义（P>0.05），证明成熟期增生性瘢痕组织中同样存在表皮干细胞。见表1，图1～4。

表1 角蛋白19和整合素β1在两组组织中的表达情况 （n=20，例）

分组 角蛋白19总分分级 整合素β1总分分级

- + ++ +++ - + ++ +++

增生性瘢痕组 0 3 15 2 0 4 15 1

正常皮肤组 0 4 16 0 0 5 15 0

χ2值 0.934 0.963

P值 0.334 0.328

2.2 生长曲线：两组总体生长趋势大致相同，第1～2天生长缓慢，第3～4天生长迅速，第5天达到高峰，第6～7天相对平稳，形成一个平台期。两组表皮干细胞生长曲线大致相同，见图5。

图5 两组表皮干细胞生长曲线

2.3 吸光度值：瘢痕组表皮干细胞与正常皮肤组表皮干细胞吸光度值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

增生性瘢痕是创伤愈合留下的痕迹，也是组织修复愈合的最终结果，轻者影响美观，重者影响功能，给患者身心可带来巨大影响，临床上对于严重影响患者功能的增生性瘢痕，常采用手术治疗，完全切除瘢痕组织，彻底松解皮肤，缺损创面以游离皮片或皮瓣覆盖，最大限度的恢复患者的功能及外观[6-8]。然而，切除的瘢痕组织常被废弃，以机体其它部位的游离皮片或皮瓣去修复创面必然会带来新的创伤[9]。表皮干细胞存在于皮肤中，通过其不断的增殖及分化，维持皮肤结构及功能的完整性[10]。近年來，随着表皮干细胞研究的不断深入，从生物细胞学角度讲表皮干细胞应用于临床已成为研究热点[11-12]。周树萍等[13]的研究发现，当增生性瘢痕成熟，即稳定后，其能够进行稳定的新陈代谢，从而维持瘢痕组织皮肤组织结构完整性及细胞内环境稳定性。基于此，本研究推测成熟期增生性瘢痕组织具有表皮干细胞，并针对其生物学特性与正常皮肤表皮干细胞进行了对比研究。

谢一帆等[14]研究发现，表皮干细胞能够特异性表达角蛋白19、整合素β1。Yoshikawa K等[15]的研究发现瘢痕组织中细胞的生长曲线及第1～7天吸光度值可反应细胞生长能力。本研究分两部分进行，第一部分利用免疫组织化学方法证明两组表皮组织中表皮干细胞的存在；第二部分从增殖能力方面对比性研究两组表皮干细胞的生物学特性。本实验标本来源于本院成熟期增生性瘢痕患者，发病均在2年以上，且临床表现趋于稳定，颜色变淡，质地变软，并经病理证实，采用中性蛋白酶消化分离瘢痕真皮细胞，避免真皮细胞对实验带来干扰，将表皮组织进行分离培养，获得种子细胞，应用免疫组织化学方法对其特异性标志物角蛋白19、整合素β1进行鉴定，结果表明角蛋白19、整合素β1在两组均呈阳性表达，且差异无统计学意义，说明所获得的种子细胞均为表皮干细胞，从而证明成熟期增生性瘢痕组织表皮与正常皮肤表皮均存在表皮干细胞，这与相关研究相符。通过绘制两组表皮干细胞的生长曲线及第1～7天吸光度值检测结果发现，两组表皮干细胞均呈S形生长，生长曲线相似，且吸光度值无明显差异。

本实验从两方面证明，成熟期增生性瘢痕组织中存在表皮干细胞，且其生物学特性与正常皮肤来源表皮干细胞相似，提示临床上切除的瘢痕组织可以再利用，提取瘢痕组织的表皮组织可作为创面修复的皮片来源。但本研究不足之处在于仅仅通过组织化学及增殖能力方面对表皮干细胞进行研究，要全面应用于临床，有待于之后从基因学及蛋白学角度进一步进行临床实验研究。

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