芝麻香型白酒堆积发酵对入窖发酵过程及原酒品质的影响

李小东，高大禹，田庆贞，蔡丛菊，夏海锋*，陈建新*

1(江南大学，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122) 2(江苏泰州梅兰春酒厂有限公司，江苏 泰州，225300)

堆积发酵作为芝麻香型白酒实际生产过程中不可或缺的工艺环节，其成功与否将直接影响入窖发酵的进行，最终影响出酒率和产酒质量[1]。在堆积发酵过程中，酒醅网罗空气环境以及生产器具的微生物，利用酒醅中的营养物质进行生长、繁殖、代谢、产热[2]。在堆积发酵结束时，发酵微生物获得大量富集、酶动力大量积累、微生物代谢合成白酒基本风味物质以及芝麻香风味成分的前体物质[3]。

堆积发酵在开放式环境下进行，受水分、空气微生物、温度以及氧气浓度等因素的影响[4]。在堆积发酵前期，空气流通、温度适宜、营养物质丰富，各种微生物快速增殖，尤其是酵母菌和霉菌[5]。同时堆积发酵后期的高温环境、不同部位酒醅氧气浓度的差异、微生物之间的相互作用，使得各种微生物进一步自然筛选，于堆积发酵结束时优势微生物菌群演替完成，为入窖发酵提供微生物基础[6-7]。入窖发酵作为堆积发酵的延续和丰富，伴随着窖内微生物菌群进一步演替以及微生物的代谢活动，最终赋予白酒特殊的芝麻香风味[8]。而影响窖内微生物菌群演替及其代谢活动的最主要因素为入窖初始微生物菌群的构成[9]。此外，万清徽等[10]通过将实际生产中堆积结束时的表层醅和中心醅按不同比例混合后进行对比发酵，发现不同混合比例酒醅会产生不同的发酵过程轨迹，最终影响原酒的香气品质。因此本文通过模拟实际堆积及入窖发酵过程，研究在不同堆积温度条件下，不同的微生物菌群演替结果(即入窖初始微生物菌群构成)对入窖发酵过程以及原酒品质的影响，为芝麻香型白酒发酵过程控制及优化技术提供实践与理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验室堆积发酵所用的高粱、小麦、麸皮、高温曲、中温曲，麸曲均取至江苏泰州梅兰春酒厂。乙酸、乳酸(色谱纯)阿拉丁；青霉素、制霉菌素，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖、氢氧化钠、盐酸等试剂(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪(1260 infinity)，Agilent；气相色谱仪(GC-2010 Plus)，日本SHIMADZU公司；生化培养箱(BSP-250)，上海博讯实业有限公司；无纸记录仪(SIN-R200D)，温度探头(Ptl00)，杭州联测自动化技术有限公司；离心机(Pico 17)，Thermo。

1.3 方法

1.3.1 实验室模拟实际堆积发酵和入窖发酵

在实验室通过程序升温培养箱进行堆积发酵和入窖发酵。堆积发酵周期为48 h，入窖发酵周期为30 d，其中堆积发酵期间隔12 h取样，入窖发酵前10 d，隔2 d取样，后20 d隔4 d取样测定指标。堆积发酵模拟两条温度曲线，曲线1为酒厂夏季堆积温度曲线，堆积顶温达50.5 ℃，为高温堆积。曲线2为酒厂冬季堆积温度曲线，堆积顶温达45.4 ℃，为低温堆积。样品1、2模拟温度曲线1进行高温堆积，其中样品1监测中心部位酒醅温度，样品2监测表层部位酒醅温度。样品3、4模拟温度曲线2进行低温堆积，其中样品3监测中心部位酒醅温度，样品4监测表层部位酒醅温度。堆积发酵结束时，样品1、3混匀后入窖发酵，而样品2、4单独取表层酒醅入窖发酵[10]。各样品入窖发酵模拟1条温度曲线(酒厂夏季窖池发酵温度曲线)，发酵顶温为41.5 ℃。堆积发酵过程中，样品1、3均匀取样，样品2、4在表层部位取样，入窖发酵过程中4个样品均匀取样测定指标。堆积，入窖发酵期间使用无纸记录仪实时监测酒醅温度变化。

1.3.2 酒醅微生物数量变化测定

称取酒醅样品10 g于90 mL无菌生理盐水中混匀，使酒醅微生物充分洗脱于溶液中，并进行梯度稀释涂布于固体营养培养基，培养至菌落长出并计数。其中酵母菌涂布于YPD固体培养基(添加100 mg/L青霉素)，30 ℃培养2 d即可计数[11]。细菌涂布于LB固体培养基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培养1 d即可计数[11]。霉菌涂布于PDA固体培养基(添加100 mg/L青霉素)，30 ℃培养4～5 d即可计数[11]。乳酸菌涂布于MRS固体培养基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培养2～3 d即可计数[12]。芽孢杆菌涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培养1 d即可计数。涂布之前需将酒醅菌液放置于恒温水浴槽中，80 ℃处理20 min，杀死其余非芽孢微生物，再进行稀释涂布平板培养[13]。

1.3.3 酒醅理化指标测定

酒醅样品还原糖、酸度、淀粉以及淀粉出酒率的测定采用白酒发酵酒醅分析方法[14-15]。酒精度采用GC测定[16]，乙醇标准曲线：y=152 551.08x+2 765.12，R2=0.994。

1.3.4 酒醅乳酸和乙酸含量测定

采用HPLC法测定[17]。乳酸标准曲线：y(mg/g酒醅)=2 134.84x+160.84，R2=0.999；乙酸标准曲线：y(mg/g酒醅)=2 704.36x+25.60，R2=0.999。

1.3.5 酒样感官品评分析

最终酒样采用暗杯盲评的方法进行[10]。

2 结果与分析

2.1 堆积发酵和入窖发酵过程中温度变化分析

如图1所示，按方法1.3.1模拟实际堆积及入窖发酵过程且均达到预计期望。各样品堆积发酵和入窖发酵酒醅实际温度与设定温度基本一致。其中在堆积发酵24 h以后，样品2酒醅温度略高于样品1酒醅温度，同样样品4酒醅温度也略高于样品3酒醅温度。可能是由于样品2、4监测表层部位酒醅温度，样1、3监测中心部位酒醅温度，而表层部位酒醅直接与空气接触，氧气充足，微生物生长繁殖，代谢产热更为剧烈，使得酒醅温度也偏高。

A-堆积发酵温度变化曲线；B-入窖发酵温度变化曲线图1 堆积发酵和入窖发酵温度变化曲线Fig.1 Temperature variation curve of accumulation and cellar fermentation

2.2 堆积发酵和入窖发酵过程中微生物数量变化分析

如图2所示，在堆积发酵前24 h各样品微生物增长较缓慢，但堆积36 h时，已达到堆积顶温，表面开始出现“白霜”层酒醅[18]，此时酵母菌和霉菌增长最为显著，均高于9.20 lgCFU/g。之后由于高温环境，霉菌和酵母菌增长速率明显变缓慢。此外总细菌、芽孢杆菌、乳酸菌数量也在不断增加，但增加趋势较平缓。

如表1所示，样品1、3由于堆积温度相差5 ℃，使得入窖初始微生物数量也存在差异。其中样品1酵母菌、芽孢杆菌数量明显高于样品3，霉菌、总细菌和乳酸菌数量与样品3较接近。样品2、4由于是表层酒醅，在整个堆积发酵过程中，氧气充足，各种微生物大量生长繁殖，其中酵母菌、霉菌数量与样品1、3相比存在显著差异，均高于9.04 lgCFU/g。另外总细菌、芽孢杆菌和乳酸菌数量也高于样品1、3。因此在不同的堆积温度条件下，微生物菌群演替过程以及入窖起始微生物数量均存在差异，且充足的氧气可促进微生物的增殖。

表1 入窖发酵第0天酒醅微生物数量比较Table 1 Comparison of microbial quantity of cellar fermentation on day 0

如图2所示，酵母菌和霉菌从入窖发酵开始就处于下降趋势，而且霉菌(好氧)下降速度高于酵母菌(兼性厌氧)。其中样品1、3至发酵结束时酵母菌和霉菌仅剩2 lgCFU/g，而总细菌、芽孢杆菌和乳酸菌数量始终较高，但变化趋势较平缓。样品2、4尽管起始微生物数量远高于样品1、3，但入窖发酵后，酵母菌下降速度与幅度均高于样品1、3，尤其是样品2中酵母菌下降速度基本与霉菌一致。两样品在发酵22 d后酵母菌已经未能检测到，霉菌至发酵结束时为2 lgCFU/g。相反样品2、4中细菌、芽孢杆菌、乳酸菌数量始终高于样品1、3。因此入窖起始微生物数量的差异，直接影响各种微生物在后期发酵过程中的演替，进而影响各种微生物的代谢活动。

A-样品1微生物数量变化；B-样品2微生物数量变化；C-样品3微生物数量变化；D-样品4微生物数量变化图2 堆积发酵和入窖发酵微生物数量变化Fig.2 Microbial quantity change of accumulation and cellar fermentation

2.3 堆积发酵和入窖发酵过程中酒醅理化指标变化分析

如图3所示，在堆积发酵前期，由于酒醅中微生物处于稳定期，其生长繁殖，代谢活动较和缓，因此淀粉消耗缓慢，酒醅中还原糖变化处于缓升或平缓趋势，另外酒精度变化也不明显。在堆积发酵后期，由于酒醅中微生物急剧生长繁殖，代谢产热，使得淀粉、还原糖迅速下降。另外酒醅中酵母菌大量增殖，酒精度也明显升高。由于整个堆积发酵过程为好氧发酵，使得酒醅酸度处于缓慢下降趋势。因此堆积发酵过程主要为微生物的富集以及相关代谢产物的积累，酒精发酵较微弱。

A-酒醅淀粉含量变化；B-酒醅还原糖含量变化；C-酒醅酸度变化；D-酒醅酒精度含量变化图3 堆积发酵和入窖发酵过程中理化指标变化Fig.3 Physical and chemical indexes change of accumulation and cellar fermentation process

如图3-D所示，样品1、3在入窖发酵前10 d，主要为酵母菌利用还原糖进行酒精发酵，产大量的酒精，这与曹维超等人研究结果类似[19]。同时氧气的消耗、酒醅温度和酒精浓度的升高也抑制酵母菌的生长，代谢[20]，因此发酵至第10天时酵母菌数量下降至5 lgCFU/g，同时酒精体积分数达到3.2%～3.5%。在此期间由于酒精发酵的剧烈进行，酒醅中淀粉下降迅速，还原糖也迅速被消耗，之后还原糖虽然平缓回升，但仍然处于较低浓度。此外细菌，芽孢杆菌，乳酸菌在此期间生长繁殖，代谢产酸均被抑制，因此在数量上变化平缓，且酒醅酸度也平缓上升。在发酵后期，由于酒精发酵几乎停止，微生物代谢活动较弱，因此还原糖回升较快，淀粉也平缓下降，直到发酵结束。此外样品3在发酵22 d之后，酸度上升明显，还原糖也有所下降，可能是由于样品3中总细菌、乳酸菌数量有所增加(图2-C)，代谢产酸造成的。由此可见在堆积发酵过程中控制适宜的微生物菌群数量可以保证入窖后酒精发酵的正常进行。

如图3所示，与样品1、3相比，样品2、4在入窖后除淀粉消耗相似之外，还原糖、酸度、酒精度变化均存在明显差异。虽然样品2、4起始微生物数量有明显优势，但在入窖发酵前期，酵母菌数量下降迅速，酒精发酵被严重抑制，酒精度远低于样品1、3(图3-D)。尤其是样品2在整个发酵过程中酒精发酵异常微弱，同时也正因为酒精发酵被抑制，其还原糖回升也快。因此样品2、4在发酵结束时出酒率远低于样品1、3，尤其是样品2的出酒率仅达8.23%(表2)。

表2 不同样品流酒量和淀粉出酒率差异比较Table 2 Comparison of liquor quantity and starch liquoryield among different samples

注：样品5为酒厂实际发酵酒醅并于实验室蒸馏。

推测可能是由于两样品中总细菌、芽孢杆菌和乳酸菌起始数量过高，代谢产酸，酒醅升酸快(图3-C)，酵母菌酒精发酵被抑制，导致发酵异常。因此入窖起始微生物菌群数量过高，入窖后各种微生物之间相互竞争，抑制作用激烈，并不利于微生物正常演替以及酒精发酵，甚至导致发酵异常。

2.4 堆积发酵和入窖发酵过程中乳酸和乙酸变化分析

如图4所示，在堆积发酵过程中，酒醅中乳酸呈下降趋势。而在堆积发酵后期，酒醅中酵母菌大量生长繁殖，代谢产乙醇，加上高温、氧气充足的堆积环境，乙醇被氧化成乙酸[21]，使得各样品中乙酸量缓慢上升。此外样品1、3和样品2、4由于取样位置不同，导致乙酸和乳酸量也存在差异。

A-酒醅乳酸含量变化；B-酒醅乙酸含量变化图4 堆积发酵和入窖发酵过程中乳酸和乙酸变化Fig.4 Lactic acid and acetic acid change of accumulation and cellar fermentation process

在入窖发酵前10 d，样品1、3中乳酸和乙酸量变化平缓，且均处于较低浓度。在此期间，样品1、3酒精发酵也正常进行，酒精体积分数迅速上升达到3.2%～3.5%(图3-D)。此外，样品3在发酵22 d以后可能是由于总细菌、乳酸菌数量增加，代谢产酸，使得乳酸和乙酸呈上升趋势。样品2、4在入窖发酵前两天乳酸量迅速上升，之后发酵至第10天乳酸量虽然变化平缓，但浓度仍高于样品1、3。另外样品2、4中乙酸量却在不断增加，浓度显著高于样品1、3，尤其是样品2在发酵第10天时乙酸量达3.45 mg/g酒醅。但在此期间样品2、4中的酵母菌数量迅速下降，酒精发酵被严重抑制，其中样品4酒精度上升缓慢且远低于样品1、3，而样品2在发酵2 d以后，酒精发酵几乎停止，酒精体积分数最低且基本未发生变化(图3-D)。最终导致样品2出酒率最低，其次是样品4，远低于样品1、3出酒率(表2)。因此导致样品2、4发酵异常的原因可能是起始微生物菌群数量过高，代谢产乙酸抑制酵母菌酒精发酵[22-23]。

2.5 不同酒样感官品评差异分析

如表3所示，样品1和样品3之间的差异主要存在于酒体风格。样品1由于堆积温度高(顶温达50.9 ℃)，且芽孢杆菌数量丰富，更有利于风味物质的合成，使得酒样焦糊香突出，呈现酱香的同时兼有芝麻香，与酒厂夏季发酵酒样接近，属于芝麻香型白酒中典型的“酱芝”风格。而样品3由于堆积温度低(顶温达45.7 ℃)，堆积发酵剧烈程度低于样品1，因此酒样焦糊香弱，芝麻香突出，与酒厂冬季发酵酒样接近，属于芝麻香型白酒中典型的“清雅芝麻香”风格。样品2、4在发酵过程中升酸过快，尤其是乙酸量迅速增加，酵母菌酒精发酵未能正常进行，酒样呈现尖酸、异味，入口酸涩味重，为发酵异常。因此在不同的堆积温度条件下，堆积发酵结束时微生物菌群构成不同，最终影响原酒的质量和酒体风格。

表3 不同酒样感官品评和酒体风格Table 3 Sensory evaluation and liquor style of different liquor samples

注：样品5为酒厂实际发酵酒醅并于实验室蒸馏。

3 结论

堆积发酵作为芝麻香型白酒生产过程中最为关键的工艺环节，通过堆积发酵，酒醅中酵母菌、霉菌、总细菌、芽孢杆菌、乳酸菌得到大量富集与筛选，在数量上达8.16～9.35 lgCFU/g，为入窖发酵提供微生物基础。

在不同堆积发酵温度条件下，入窖发酵初始微生物菌群数量不同，其中霉菌、总细菌、乳酸菌数量较接近，而酵母菌和芽孢杆菌数量差异明显。入窖后在厌氧以及特定发酵温度条件下，伴随着微生物菌群进一步演替并进行相关代谢活动，最终出酒率正常，原酒质量合格，但酒体风格不同。其中高温堆积条件下出酒率稍微偏低，但利于生香，酒样呈现酱香的同时兼有芝麻香，为“酱芝”风格。而低温堆积条件下利于产酒，酒样芝麻香突出，为“清雅芝麻香”风格。在堆积发酵结束时，表层酒醅中各种微生物数量处于绝对优势，其中酵母菌、霉菌、总细菌数量达9.04～9.35 lgCFU/g。单独取表层酒醅入窖后，酒醅升酸快，尤其是乙酸量迅速增加，酵母菌下降迅速，最终出酒率低，原酒质量不合格。可能是由于入窖初始微生物菌群数量过高，入窖后微生物之间相互竞争、抑制作用激烈，最终细菌成为整个发酵过程的优势菌群，代谢产乙酸抑制酵母菌酒精发酵。因此在堆积发酵过程中控制适宜的微生物种类和数量对入窖发酵过程、原酒质量以及酒体风格有重要影响。

由于堆积发酵的开放环境，如何更加稳定，有效地调控堆积发酵过程，为入窖发酵提供更为合适的微生物基础以及代谢产物基础，需要更加深入研究微生物之间的相互作用机理以及其他环境因素对堆积发酵的影响。

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