自制扣式负压抽提装置在甲型流感病毒检测中的应用*

梁敏华 庄健海 吴英 叶俏霞 陈家钖 简少珍 肖海艳

（广东省佛山市中医院 佛山528000）

流行性感冒是一种常见的临床病症，具有传播速度快、易引起暴发流行的特点，其中甲型流感病毒侵袭性最强，危害性最大，其RNA依赖RNA聚合酶进行复制和转录，然而流感病毒RNA聚合酶缺乏自身校对能力，因此病毒RNA合成过程中易发生较大的误差率，从而使得流感病毒基因组突变率较高，病毒进化速度较快[1]。以往临床中常用液-液萃取方法对其RNA进行提取，但需要使用大量的酚、氯仿等有机溶剂，对环境影响大，因而不被临床接受使用。随着医学技术的不断发展，目前临床中常用自制扣式负压抽提装置对流感病毒RNA进行检测与提取，具有良好的效果[2]。本文将重点探讨自制扣式负压抽提装置在甲型流感病毒检测中的应用效果。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机抽取我院2015年7月～2017年7月420份呼吸道分泌物样本，用病毒保存专用管置于－80℃保存备用，实验前解冻至室温。运用随机数字表法将其分为实验1组与实验2组，实验1组180份，实验2组240份，依据不同的抽提方法，实验1组采用的是柱式抽提法，实验2组采用的是自制扣式负压抽提法。

1.2 检测方法 实验1组采用的是柱式抽提法，方法如下：取200 μl样本并在其中添加250 μl的悬浮液使二者充分混合，之后再向其中添加250 μl的裂解液，放置约4 min后使用离心机离心；在其中添加450 μl的去蛋白液并进行离心；将离心柱转移至新的离心管后添加50 μl的TE缓冲液，离心后即可收集RNA。实验2组是自制扣式负压抽提法，方法如下：在96孔板上按照要求在实验前分批加入200 μl样本、裂解液、洗涤液、磁珠液、洗脱液和石蜡油，放置好反应板和磁珠棒后执行仪器上程序并运行，自动化结束后，将洗脱液转移至离心管中，进行约15 min的离心操作，之后提取标本中白细胞层并将其放置于另一试管中，向其中添加红细胞溶血素-SYS-SLS，比例为1∶5，在冰上孵育10 min，期间涡旋振荡2次。之后在4℃环境下离心10 min，弃上清液，加入500 μl的红细胞溶血素，重悬沉淀白细胞（WBC），重复上一过程后加入400 μl的配套提取试剂里的裂解液，振荡重悬沉淀，将沉淀的WBC分成两份，分别放置于两支不同试管中，向试管中添加0.1%焦碳酸二乙酯，在室温下浸泡2 h，使用无菌水进行清洗，在100℃环境下进行15 min的烘烤与灭菌，最终完成收集RNA。

1.3 观察指标 （1）两种方法的抽提效率比较。（2）比较两种方法的定量检测结果，主要包括RNA的浓度与纯度。（3）观察两种方法对RNA完整性的影响。

1.4 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件，计数资料用阳性率表示，采用χ2检验，各组间定性结果采用Kappa检验；计量资料用（）表示，组间均数比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法的抽提效率比较 实验1组对样本的抽提时间为62 min，实验2组样本的对抽提时间为51 min，实验2组的抽提效率明显高于实验1组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两种方法的抽提效率比较

2.2 两种方法的定量检测结果比较 经提取检测后得知，实验2组的RNA浓度为（1.625±0.134）μg/μl，实验 1组的 RNA 浓度为 （1.542±0.125）μg/μl。经提纯得知，实验2组的RNA纯度明显高于实验1组，差异具有统计学意义（P＜0.05），并且两种方法 OD260/OD280的95%CI均位于 1.80～2.00之间，OD260/OD230的95%CI均大于2.00，数据相关性良好，具体内容。见表2。

表2 两种方法的定量检测结果比较

2.3 两种方法对RNA完整性的影响 自制扣式负压抽提法对RNA完整性的破坏率为0.83%（2/240），而柱式抽提法对RNA完整性的破坏率约为 3.33%（6/180）。

3 讨论

甲型流感病毒具有较强的致病性，对人体的健康将产生严重的危害，为有效地抑制甲型流感病毒的传播，需要对其RNA进行提取，并进一步抑制其RNA聚合酶的复制与转录，如此才能有效地切断其传播途径，在较大程度上确保人们的健康[3]。以往在临床中主要使用配套负压抽提装置对其RNA进行提取，虽然能够获得一定的效果，然而传统的液-液萃取方法需要使用大量的酚、氯仿等有机溶剂，对环境影响大，使用的焦碳酸二乙酯处理水具有较强的致癌性，提取与沉淀都可导致RNA出现一定的损失，并且其操作过程复杂，需要消耗大量时间，同时安全性较低，提取效率低，因而不适合大批量标本操作，已难以适应临床实验室的要求，逐渐被淘汰[4]。随着医学技术的不断发展，目前主要采用自制扣式负压抽提法。自制扣式负压抽提法提取系统在操作过程中采用96孔板法，对RNA破坏较小，使RNA的降解减少，加之其提取效率高，可有效确保RNA的完整性，因而被广泛使用[5～8]。OD280 nm与OD230 nm分别代表吸光度分别代表蛋白质与有机溶剂含量，依OD260/OD280值与OD260/OD230值可有效的反映出提取RNA纯度，两种提取方式提取的RNA纯度均较好，但依据实验结果可知，自制扣式负压抽提法所提取的RNA纯度更高。

随着对甲型流感病毒感染机制的深入了解及各类规范化指南要求，临床上对甲型流感病毒RNA检测的需求日趋提升，对RNA的提取提出了更高的要求。柱式负压抽提法在我国临床实验室应用广泛，但配套的负压抽提装置标本处理能力低，工作效率差，常因与抽提柱的配合性差而导致RNA提取质量不稳定，使其越来越难以满足临床上的需求变化，成为甲型流感病毒RNA检测的“瓶颈”。因此，研制一种大容量扣式负压抽提容纳装置十分有必要，不但能推广良好的技术设施，解决实践中出现的难题，也可总结经验，为提升RNA提取质量提供理论依据，为进一步的研究打下基础。依据本研究结果可知，通过使用自制大容量扣式负压抽提装置提取RNA，对于甲型流感病毒RNA的抽提效率达到4.71份 /min， 并 且 OD260/OD280值 与OD260/OD230值 分 别 达 到 （1.976±0.125）与（2.483±0.349），与黄秋香等[9]关于 TritonX-114 液相分离法去除流感单价病毒原液中内毒素的实验研究结果一致，主要原因在于该种方式对病毒RNA的影响较小，能够形成有效的保护，并且由于在较大程度上排除了外界因素的干扰，因而获得了较高的提取纯度。

综上所述，本文认为自制扣式负压抽提装置在甲型流感病毒检测中的应用具有显著效果，不仅能够提升抽提效率，同时能够有效地提升抽提纯度，更能够为检验师提供可靠的检测信息，可作为未来一段时间内检测甲型流感病毒的首选方式，并且为后续治疗提供可靠保障。由于本次样本容量有限，因而关于自制扣式负压抽提装置在甲型流感病毒检测中的应用所产生的深远影响需要进一步观察。除此之外，检验师还需要不断加强对该种抽提技术的研究，如此才能提供更加准确的检测信息。

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