食欲素-B抑制大鼠脑缺血再灌注损伤

徐 超，王春梅，白 波*

(1.山东大学 齐鲁医学部，山东 济南 250012; 2.济宁医学院 神经生物学研究所，山东 济宁 272067)

在4.5 h内静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂(recombiant human tissue type plasminogen activator，rt-PA)是处理急性缺血性脑卒中最有效方式。由于相对严格的适应症及禁忌症，接受溶栓治疗的患者比例较低[1]。在溶栓后，由于细胞内Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性和线粒体功能障碍等，使再灌注后的脑组织发生继发性损伤，导致患者多数预后不佳[2]。因此，研究能够减轻脑缺血再灌注损伤的新型药物很重要。

在大鼠下丘脑腹外侧核中首先发现食欲素(orexin)，它主要在摄食、能量代谢和睡眠-觉醒等生理功能中发挥作用。其前体经过剪接修饰产生食欲素-A(OXA)与食欲素-B(OXB)。两者作用于脑内广泛分布的受体发挥作用， 食欲素-B可与食欲素1型受体(OX1R)和食欲素2型受体(OX2R)结合[3]。 食欲素-A在发作性睡病、抑郁症和阿尔茨海默病等疾病中起到神经保护作用[4- 6]。但对食欲素-B的研究相对较少。本实验在脑缺血再灌注后的大鼠模型，通过侧脑室注射食欲素-B，探讨食欲素-B在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级Wistar大鼠，雄性，鼠龄7～8周，体质量200～230 g[济南朋悦实验动物有限公司，合格证号SCXK(鲁)20140007]。

1.1.2 主要试剂：Orexin-B(Phoenix Pharmaceuticals公司)；Orexin receptor 2抗体、AKT抗体、p-AKT抗体、p-GSK- 3β抗体及二抗羊抗鼠和羊抗兔抗体(Cell Signaling Technology公司)； 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理：随机将大鼠分为假手术组(control)、缺血再灌注组(I/R)、缺血再灌注+PBS组(I/R+PBS)和缺血再灌注+orexin-B组(I/R+OXB)。制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occulusion，MCAO)模型[7]，进行Zea-Longa 5级神经行为学评分以确定模型是否制备成功，于脑缺血2 h后再灌注24 h。在再灌注早期(20 min)注射10 μL的食欲素-B，其浓度根据预实验确定为1 μg/μL。

1.2.2 TTC染色检测脑梗死体积： TTC是一种脂溶性光敏感复合物，常用来检测哺乳动物组织的缺血梗死状态。活细胞内的脱氢酶将TTC还原为红色甲瓒化合物TPF(1,3,5-triphenylformazan)[8]。对于缺血组织，因脱氢酶活力丧失呈现苍白色，而正常组织呈深红色。为排除梗死侧大脑水肿对计算的影响，采用公式：非梗死侧半球面积-梗死侧半球正常脑组织面积/非梗死侧半球面积×100%，计算半球脑梗死比并评估脑梗死程度。

1.2.3 Western blot检测大鼠损伤侧大脑海马OX2R、p-AKT和p-GSK- 3β蛋白表达： 提取损伤侧海马蛋白，根据所测蛋白浓度决定待测样品上样体积，进行SDA-PAGE蛋白凝胶电泳和转膜。经抗体孵育后，加ECL试剂置于凝胶成像仪中显色并留存图片，用Image J图像分析软件对条带进行定量分析。

1.2.4 跳台实验：模型制作成功后1周，进行大鼠跳台实验[9]。本实验使大鼠在箱内自由适应3 min，共适应3次，间隔30 min。训练24 h后，记录动物自放上平台后至跳下平台的潜伏期、5 min内跳下平台的错误次数, 此为动物的最终记忆成绩。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Orexin-B明显降低脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积

I/R组较对照组有明显梗死灶。I/R+OXB组较I/R组和I/R+PBS组，梗死区域面积显著减小(P<0.05)(图1)。

A.TTC staining；B.infarct size ratio in different groups；*P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS

2.2 各组大鼠海马组织OX2R、p-AKT、p-GSK- 3β的蛋白表达

与对照组相比，I/R组海马中OX2R及p-AKT显著降低(P<0.05)，而p-GSK- 3β升高(P<0.05)。IR+OXB组上述指标均变化明显缓解(P<0.05)。(图2，表1)

图2 比较大鼠海马组织中OX2R、p-AKT和pGSK-3β的蛋白表达Fig 2 Comparison of the expression of OX2R, p-AKT, p-GSK- 3βin hippocampus of rats in four groups

2.3 各组大鼠跳台实验潜伏期及错误次数

I/R组较对照组潜伏期时间缩短，而错误次数增多(P<0.05)，而I/R+OXB组上述改变显著减轻(P<0.05)。

表1 比较4组大鼠海马OX2R、p-AKT和p-GSK- 3β的蛋白表达变化

△P<0.05 compared with contral;#P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS.

表2 4组跳台实验潜伏期时间及错误次数比较

△P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS.

3 讨论

GSK- 3β是一种参与糖代谢、细胞增殖和凋亡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[10]。在体内它受AKT信号通路调控，当AKT活化后，可磷酸化GSK- 3β的Ser9残基，从而抑制GSK- 3β的活性，发挥细胞保护作用。有报道食欲素神经元属于葡萄糖敏感型神经元，血糖较低时，该神经元被刺激而活化[11]。

本实验采用经典MCAO模型模拟大脑缺血再灌注状态，并在治疗期内侧脑室注射食欲素-B，发现食欲素-B治疗组脑梗死体积较损伤组明显减少，表明食欲素-B可以减轻脑缺血再灌注后的损伤；实验还表明损伤组食欲素受体2的蛋白表达较对照组下调，提示该受体参与损伤过程，治疗组较损伤组相比，受体数量升高，表明食欲素-B可抑制脑缺血再灌注损伤。治疗组p-AKT蛋白表达升高，p-GSK- 3β蛋白表达下降，表明食欲素-B可能通过活化下游的AKT，增强磷酸化，抑制p-GSK- 3β的活性，继而抑制糖原合成及促进神经胶质细胞增殖。跳台实验，观察到食欲素-B治疗组的潜伏期较损伤组延长，错误次数减少，表明治疗组大鼠的学习记忆能力较损伤组明显提升，趋利避害的认知能力得到加强。

综上，初步证明脑缺血再灌注后食欲素受体增多，参与细胞凋亡，食欲素-B可能通过激活p-AKT,降低下游p-GSK- 3β的活性从而抑制糖原合成，升高脑血管中血糖浓度，抑制神经元凋亡。食欲素-B能提高p-AKT活性，抑制p-GSK- 3β活性，有望成为治疗脑缺血再灌注的神经保护药物，其确切机制有待进一步探讨。

参考文献：

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