马尾藻提取物对亚硝化反应的抑制作用

李秀菊，袁 梦，黄嘉丽，李若齐，颜亨梅，汪 波

(北京师范大学珠海分校 工程技术学院，珠海 519085)

硝酸盐和亚硝酸盐摄入过多会对人体造成危害[1]，具有强氧化性的亚硝酸盐能使正常的亚铁血红蛋白转变成高铁血红蛋白而失去运氧功能[2]。当人体血液有20%的亚铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白时就会造成缺氧症状，临床表现为皮肤黏膜青紫，头晕、呕吐、全身无力，严重者会因呼吸衰竭而死[3]。亚硝酰胺中甲基以及亚硝基脲可以使大鼠、小鼠等实验动物子代产生先天畸形，特别是中枢神经系统畸形[4]。因此，合理有效地控制体内的亚硝酸盐及亚硝胺具有重大意义。现今药物的研究主要以陆生植物为主，且其中大部分为名贵中药，这并不利于药物的开发应用。于是，人们把目光投向有着巨大发掘和利用空间的海洋，逐渐关注到马尾藻这种种植周期短，投入成本低的温暖性海藻[5]。在中国大多数沿海地带有马尾藻生长，并能够实行大规模养殖，所以马尾藻作为原材料来源丰富[6]。

姚勇和孟庆勇对辐射损伤型小鼠服用马尾藻提取剂后，发现马尾藻提取剂所制备的口服液具有优良的抗辐射效果，并且作用效果与马尾藻提取剂的用量呈正相关；由此可见，马尾藻具有良好的抗辐射能力[7]。海藻多糖在实验中已验证能提高哺乳动物非特异性免疫和特异性免疫,能大幅度地增强小鼠的细胞免疫和体液免疫能力及其腹腔巨噬细胞的吞噬能力[8]。肖为等利用乙醇进行全缘马尾藻的粗提取，并测定了全缘马尾藻提取物的抗氧化活性及对亚硝化反应的抑制作用，其结果表明，全缘马尾藻醇提取物具有一定的抗氧化能力，且其对清除体内亚硝酸盐与阻断亚硝胺合成有一定效用[9]。

杨亚云对藻泥和藻粉的研究表明，藻泥和藻粉具有一定的保湿性，以藻多糖作为基本原料制成的护肤霜能增加皮肤的胶原蛋白含量和皮肤的弹性值[10]。这表明马尾藻具有综合开发利用的广阔前景，如开拓它的美容护肤品市场，提高其附加经济价值。

多数海藻的提取物质具有抗氧化和抗肿瘤的功效，但是关于马尾藻提取物清除亚硝酸盐以及阻断亚硝胺合成的报道并不多见[9]。在验证本实验所用的马尾藻是一种安全无污染原材料的基础上，测定了马尾藻对亚硝胺合成的阻断率以及对亚硝酸盐的清除率，从而对马尾藻粗提物抑制亚硝化作用的能力进行研究分析，为马尾藻的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

海藻来源：中国珠海东澳岛马尾藻(Hizikiafusiformis)。

主要材料前处理：购得的新鲜马尾藻去除杂质洗净，再用蒸馏水冲洗2次，放入80℃烘干机烘干至恒重后，剪碎。马尾藻粉末过筛后储存于干燥的玻璃瓶备用[11]。

采用固-液浸提法。称取5份重量分别为10 g的干燥马尾藻样品，分别用140 mL不同浓度(0%、25%、50%、75%和100%)的乙醇置于4℃冰箱浸提3 d。真空抽滤得到不同浓度的醇提液。

1.2 实验方法

农药残留和重金属残留的测定：砷详细步骤见GB/T5009.11—2003[12]；铅详见GB5009.12—2010[13]；有机磷或氨基甲酸脂类农药详见GB/T20769—2008[14]。

马尾藻提取物对亚硝胺合成阻断率的测定采用α-萘胺法[15]；马尾藻对亚硝酸盐清除率采用盐酸萘乙二胺比色法[16]。

2 结果与分析

2.1 重金属和农药残留检测结果

根据表1可知铝的含量为76.7 mg/kg，远远低于DB53/T288—2009中的要求，故马尾藻中铝的含量在安全范围内。砷、铜、镉的含量均在国标或者地标要求的安全范围内。根据表2可知，马尾藻的各项农药残留均未检出；由此可知，本实验所用的马尾藻是一种安全、无农药残留的原材料。

表1马尾藻重金属残留检测结果(mg/kg)Table 1 Detection results of heavy metal residue in Hizikia fusiformis

表2马尾藻农药残留检验结果Table 2 Test results of pesticide residues in Hizikia fusiformis

2.2 马尾藻对亚硝胺合成阻断结果

根据图1可知，马尾藻具有很强的阻断亚硝胺合成的能力，最高可达100%。当提取的乙醇浓度在0%～50%之间时，马尾藻阻断亚硝胺合成的能力随着乙醇浓度的提高而升高。乙醇浓度在50%～75%之间时，清除效果最佳，清除率高达100%。之后随着乙醇浓度的提高，马尾藻阻断亚硝胺合成的能力反而降低。

图1 不同浓度乙醇提取液对亚硝胺合成的阻断率Fig 1 Nitrosamine synthesis blocking rate of H.fusiformis extract with different ethanol concentrations

2.3 马尾藻对亚硝酸盐的清除率

由图2可知，马尾藻提取物有较强的清除亚硝酸盐的能力。提取马尾藻的乙醇浓度在0%～75%之间时，马尾藻提取物对亚硝酸盐的清除率与乙醇浓度呈正相关，在乙醇浓度为75%时，马尾藻提取物对亚硝酸盐的清除率最高值达到53.33%。之后马尾藻对亚硝酸盐的清除率随着乙醇浓度的升高而降低。

图2 不同浓度乙醇提取液对亚硝酸盐的清除率Fig 2 Nitrite scavenging rate of H.fusiformis extract with different ethanol concentrations

3 讨论

检测结果表明，马尾藻中铅等高危重金属未检出，铝的含量为76.7 mg/kg，远远低于DB53/T288—2009的要求；而敌敌畏、氧乐果、甲氰菊酯等农药残留未检出；由此表明：实验所用马尾藻安全、无农药残留。

在模拟人体胃液条件下(温度37℃、pH 3.0)，马尾藻醇提物可一定程度上阻断亚硝胺合成，当乙醇浓度为0%时，马尾藻粗提物对亚硝胺的合成阻断率可达到72.59%；之后阻断率随着乙醇浓度的升高而提高，乙醇浓度在50%～75%之间时对亚硝胺合成的阻断能力最强，清除率达到100%。 当乙醇浓度继续升高时，马尾藻粗提物对亚硝胺的合成阻断率逐渐下降，当乙醇浓度为100%时，阻断率下降到82.94%。肖为等测定在不同乙醇提取比例下全缘马尾藻的提取物对亚硝胺合成的阻断能力，得出用75%乙醇提取的醇提物对亚硝胺合成的阻断能力最强，达到22.78%[9]。分析结果产生差异的原因可能为原材料采用的马尾藻亚种不同，不同亚种之间的活性成分的种类和比例存在差异，在提取过程中得到的提取物的成分与比例有差异，从而导致了马尾藻提取物对亚硝胺的阻断能力有差异。

同时，马尾藻提取物有清除亚硝酸盐的能力。乙醇浓度在0%～75%之间时，亚硝酸盐的清除率逐渐提高，并且在25%～50%之间清除率显著提高，当醇提液的浓度是75%时，马尾藻粗提物对亚硝酸盐的清除效果最佳，清除率达到最高值53.33%。随后随着乙醇浓度的增加，亚硝酸盐的清除率逐渐下降，当乙醇浓度为100%时，清除率下降到42.10%。究其原因可能是马尾藻中的活性成分分为脂溶性和水溶性[17]，可能当乙醇浓度为75%时，有机溶剂与水的比例十分契合马尾藻活性成分的萃取的最佳要求，从而萃取的活性成分含量最高，对亚硝酸盐的清除效果最佳。

在海藻活性成分的提取方法中，水提法和醇提法具有操作简单，对设备要求低，成本低廉的优点。本项目采用的提取方法为醇提法，相对于水提法，醇提法提取时间短，方便快捷，但是提取率较低，水提法用时长，但提取效率高，成本低[18]。同时，不同的乙醇浓度会影响活性成分的浸出率，肖为等[9]测定在不同乙醇提取比例下全缘马尾藻的提取物对亚硝酸钠的清除能力，得出用0%乙醇提取的醇提物对亚硝酸钠的清除能力最强，达到12.42%；随着浸取液中乙醇比例的增加，提取物对亚硝酸钠的清除能力呈下降趋势。分析实验结果产生差异的可能原因有如下两条：1)本实验与肖为等人的实验采用的原材料——马尾藻亚种不同，不同亚种之间的活性成分的种类和比例存在差异，最终导致了实验结果的不一致。2)肖为等人实验的样品液是烘干后再溶解的无醇样液，本实验所测定的样液是含有乙醇的粗提液，可能是由于乙醇的存在影响了粗提物对亚硝酸钠的清除能力。

本项目当醇提液的浓度是75%时，马尾藻粗提物对亚硝酸盐的清除效果最佳，当乙醇浓度在50%～75%之间时对亚硝胺合成的阻断能力最强，由此分析乙醇浓度对马尾藻提取物的浸出率的影响。张郁松探究乙醇浓度对沙棘果渣中总黄酮提取的影响时发现，提取效果以50%浓度最好，分析原因可能是乙醇浓度过高会溶解一定的脂类物质，从而降低了乙醇对黄酮类物质的溶解[19]。魏颖等优化苹果渣中多酚的提取工艺，发现乙醇的体积分数为60%时提取效果最好[20]。尹丽和郭小慧通过正交试验对银杏叶总黄酮的提取工艺进行优化，发现乙醇浓度75%是提取的最佳条件[21]。通过75%乙醇消毒效果最好以及乙醇消毒原理猜想：乙醇具有很大的渗透能力，能进入细胞体内，使细胞内蛋白凝固，杀死细胞，从而使细胞膜丧失通透性，胞内物质浸出，而当乙醇浓度过高时，乙醇很快使细胞表面的蛋白质凝固，从而形成一层蛋白质硬膜，这层硬膜对细胞有保护作用，阻止乙醇进一步渗入细胞，胞内物质浸出率下降。只有当乙醇与水以一定比例混合时，乙醇才能有效杀死细胞，改变细胞膜的通透性，达到最高的提取率。

4 结论

实验结果表明：乙醇浓度为50%和75%时，马尾藻提取物对亚硝胺合成的阻断率高达100%；乙醇浓度为75%时，马尾藻提取物清除亚硝酸盐的能力最好，清除率为53.33%。由此可知，马尾藻对亚硝化反应具有良好的抑制作用。因此，进一步研究马尾藻醇提物的有效成分和功能，并加以开发利用，对预防癌症有一定的积极意义。

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