黄瓜果刺大小遗传分析

狄胜强 李 豪 栾倩倩 王丽娜 李 强 任仲海

（山东农业大学园艺科学与工程学院，山东果蔬优质高效生产协同创新中心，农业部黄淮地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

黄瓜刺瘤密度及大小决定了黄瓜果实的光滑程度。黄瓜刺瘤由果刺和果瘤两种结构组成，而果刺又包括上部单细胞针状刺和下部多细胞球状基座（Yang et al.，2014）。多细胞基座决定果刺大小，当基座小到一定程度时，果刺即成为小且柔软的毛刺，这时黄瓜果实也表现为光滑的外观性状。目前对黄瓜刺瘤的研究主要集中在刺瘤的有无及密度方面（杨双娟 等，2011；Li et al.，2015；Pan et al.，2015；Zhang et al.，2016；Xie et al.，2018）， 虽 然已有对小刺基因定位的报道（杜辉，2008），但是果刺大小的遗传规律仍不清楚。

曹辰兴和郭红芸（1999）报道了无刺黄瓜自然突变体（glabrous 1，gl1），该突变体地上部均无毛，叶片有光泽。接着，曹辰兴等（2001）对无刺基因（gl1）与果瘤基因（Tu-tu）的关系进行了初步探索，发现果刺和果瘤基因互作可产生有瘤有刺、无瘤有刺、无瘤无刺3种黄瓜类型，表明gl1对果瘤基因存在隐性上位作用。果瘤基因Tu编码1个C2H2型锌指蛋白，通过促进CTK（细胞分裂素）的合成诱导果瘤发育（Zhang et al.，2010；Yang et al.，2014）。Li等（2015）利用 gl1 突变体，定位并克隆了CsGL1，该基因编码HD-ZIPⅠ亚家族的1个转录因子。杨双娟等（2011）利用叶片无毛突变体NCG-042，以F2世代为作图群体初步将无毛基因gl-2定位在黄瓜2号染色体上。控制黄瓜果刺和毛状体起始及发育的CsGL3也已被克隆，该基因编码HD-ZIPⅣ亚家族的1个转录因子，并被证明是CsGL1的上位基因（Pan et al.，2015；Cui et al.，2016）。CsGL3基因还参与调控黄瓜果刺密度，其启动子区的812 bp片段替换是决定黄瓜果刺密度的关键因素（Zhang et al.，2016）。转基因分析表明WD40家族基因CsTTG1也可以调控黄瓜刺瘤大小和密度（Chen et al.，2016），且是独立于CsGL1的途径来调控果刺及蜡粉腺毛的起始和发育。另一个调控果刺密度的基因ns （Csa2M264590）也已被克隆，功能注释表明，该基因属于Aux/Lax家族，编码类似生长素转运蛋白3，参与生长素信号转导途径（Xie et al.，2018），NS负调控果刺密度。黄瓜小刺基因（ss）只有初步的定位结果（杜辉，2008）。

黄瓜果刺对保护果实免受病虫及紫外线等的伤害具有一定作用。黄瓜多细胞果刺的发育机制与拟南芥中单细胞表皮毛发育机制有着显著的不 同（Hülskamp et al.，1999；Hülskamp，2004；Schellmann & Hülskamp，2005；Li et al.，2015）。黄瓜果刺大小遗传规律分析与基因挖掘，有助于阐明多细胞果刺发育机制，也对黄瓜果实光滑性状的改良具有重要的理论和指导意义。

本试验以大果刺黄瓜自交系CNS5和小果刺黄瓜自交系RNS4为亲本，构建了P1、F1、P2、B1、B2和F26世代群体，利用主基因+多基因混合遗传模型（盖钧镒 等，2003），对黄瓜果刺大小（基座直径）的遗传规律进行初步分析，以期为制定果刺大小相关基因定位策略提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用亲本材料P1和P2分别为CNS5和RNS4，均为山东农业大学蔬菜分子遗传学实验室保存的中国华北型黄瓜自交系。亲本CNS5果刺大，RNS4果刺小，两亲本间果刺基座大小差异明显（图1）；2015年秋季将两亲本种植于山东农业大学园艺试验站温室，杂交获得子代F1（CNS5×RNS4）和 F1′（RNS4×CNS5）。2016年春季种植 F1，自交获得子代F2，同时用2个亲本分别与F1回交获得回交群体B1（CNS5/RNS4//CNS5）和B2（CNS5/RNS4//RNS4）。以此获得CNS5和RNS4杂交组合的 6 个世代群体，即 P1、F1、P2、B1、B2和 F2。

图1 亲本及F1的幼果和两亲本果刺基座对比

1.2 田间试验

2016年秋季及2017年春季分别将6个世代群体种植于山东农业大学园艺试验站拱棚。播种前施腐熟农家肥。株距40 cm，行距50 cm，每行10株，生育期田间正常水肥管理，及时除草，防治病虫害。选取开花当天顺直无畸形的幼果，去掉顶花，拍照后用于果刺基座测量，每株取3个幼果，即为3次生物学重复。

1.3 黄瓜果刺测量部位及测量时期

黄瓜果刺的发育是一个循序渐进的过程，因而确定具体的测量部位和测量时期对表型鉴定起着至关重要的作用。依据Chen等（2016）介绍的方法，本试验将果刺基座直径的测量部位确定为幼果中间部分（图2）。该部位的果刺形状整齐、规则，能够代表整瓜的果刺大小。

图2 黄瓜幼果果刺基座测量部位及局部放大图

两亲本的果刺发育进程统计表明（图3），黄瓜雌花幼果开花前是黄瓜果刺的快速发育期，果刺（主要是基座）急剧膨大，至开花当天果刺发育基本达到最大，开花后果刺膨大趋于平缓。鉴于开花当天（0 DAA）的幼果花瓣完全展开，颜色鲜艳黄亮，是黄瓜幼果发育阶段最易辨识的形态标记；且果刺已过了快速膨大期，能够代表黄瓜果实的果刺大小；统一将开花当天的黄瓜幼果确定为果刺表型鉴定的最佳时期，力求表型鉴定的准确性与可靠性。

图3 黄瓜果刺发育过程

1.4 果刺基座测量方法

果刺基座测量所用的软件为Image J，使用默认参数（Pascau & Mateos，2013），其步骤为：①双击打开Image J，进入File菜单，选择Open导入目标照片。② 通过Ctrl+来调节照片大小至200%且果刺基座轮廓清晰。③ 定义工具栏上点选直线工具图标，在照片中直尺上对应长度画1条直线，进入Analyze菜单，点击Set Scale，设定照片中相对比例的实际大小。Distance in pixels为照片中的直线长度，Known distance为实际的直线长度。④ 在幼果中间部位，选择圆形规则的果刺基座，直线垂直测量果刺基座直径（图2），通过快捷键Ctrl+M统计所选的果刺基座直径。⑤ 每个果实测量10个果刺，统计完成后将数据储存为 *.xlsx文件。

1.5 统计分析方法

数据整理采用软件Microsoft Excel 2007，基本参数统计、差异显著性比较使用软件DPS7.05（唐启义和冯明光，2007），多世代频率作图及曲线拟合采用软件Origin Pro 2016（叶卫平，2015）。使用由盖钧镒和章元明等提出的主基因+多基因混合遗传模型分离分析法对6世代P1、F1、P2、B1、B2和F2进行联合分析。通过极大似然分析和IECM（Iterated expectation and conditional maximization）算法估计混合分布中的相关分布参数（章元明和盖钧镒，2000），再依据 AIC（Akaike’s information criterion）值最小原则选择最佳模型并进行适合性检验，包括均匀性U12、U22和U32检验，Smirnov检验（nW2）和Kolmogorov检验（Dn），选择最优模型。最后采用最小二乘法依据最优模型的各成分分布参数估计遗传参数。遗传分析R语言优化软件包SEA1.0由华中农业大学章元明教授惠赠。

2 结果与分析

2.1 表型数据分析

2.1.1 果刺基本参数 亲本CNS5（P1）果刺大且多（图1-B），亲本RNS4（P2）果刺小且少（图1-C），幼果大小差异不大，F1果刺大小（基座直径）介于两亲本之间。统计结果表明，P1、P2与F1相互之间果刺大小差异极显著，适合进行遗传特性分析（图4）。

图4 亲本与杂交一代果刺基座直径统计

由表1可知，各世代变异系数均小于15%，说明数据精度符合进一步分析的要求。2016年秋季和2017年春季各世代种植分离群体中，F1果刺大小均介于两亲本之间。B1、B2和F2果刺大小也介于两亲本P1与P2之间（表1）。连续两年的F1果刺大小基本一致且都介于两亲本之间，说明控制果刺大小的等位基因不是简单的显隐性关系。

2.1.2 分离世代次数分布及曲线拟合 由分离世代可知，在2016年秋季群体中，50株B1和48株B2世代的分离值都介于两亲本之间，而在102株的F2群体中出现最小的果刺基座，为0.61 mm，虽然小于P2的最小果刺基座0.63 mm，但仍在误差范围之内，应该不是负向超亲优势（表1）。2017年春季群体中，B1中最大果刺基座为1.19 mm，高于当年亲本P1的最大果刺基座1.10 mm，虽差异明显，但群体中仅有2株，不足以说明存在正向超亲优势（表1）。果刺基座表型值连续分布，对各分离世代的频率分布进行曲线拟合，结果表明，2016年秋季和2017年春季的果刺基座表型值在各分离世代B1、B2和F2中均表现出正态分布（图5），呈现数量遗传特征。

表1 CNS5×RNS4 6世代果刺基座直径基本参数统计

图5 2016年秋季和2017年春季果刺大小频率分布

2.2 果刺大小主基因+多基因遗传模型分析

2.2.1 果刺大小遗传模型选择 利用主基因+多基因混合遗传模型的6世代（P1、F1、P2、B1、B2和F2）联合分析法，估算出果刺大小的5类24种遗传模型的极大似然函数值和AIC值（表2）。根据最佳模型的AIC值最小原则从表2中选出AIC值最小的模型以及与最小AIC值最接近的1个遗传模型作为备选模型。即在2016年秋季AIC值最小为-580.5的C-0模型作为可能的最佳候选模型，接近最小AIC值-576.5的D-0模型为备选模型。2017年春季C-0模型的AIC值最小，为-1 422.5，也作为可能的最佳候选模型，AIC值为-1 418.5的D-0模型作为备选模型（表2）。

表2 CNS5×RNS4组合后代各遗传模型的AIC值

2.2.2 果刺大小候选模型的适合性检验 对选出的候选模型进行均匀性检验，Smirnov（nW2）检验和 Kolmogorov（Dn）检验（表3），选出统计量达显著水平个数较少的模型为最优模型。结果表明，2016年秋季群体中，C-0和D-0模型中没有统计量的差异达到显著水平。2017年春季群体中，C-0和D-0模型中均有1个检验统计量差异达到显著水平。再结合AIC值最小原则，选择C-0作为连续两年的果刺大小最优遗传模型，即为典型的加性-显性-上位性多基因混合遗传模型，无主基因存在，多基因加性和显性效应、上位性效应累计均为正向。

表3 CNS5×RNS4群体适合性检验

2.2.3 果刺大小遗传参数估计 对适合果刺大小的C-0模型进行遗传参数估计，一阶遗传参数结果表明，2016年秋季和2017年春季的6个世代群体的平均值差异不大（表4）。从二阶遗传参数的估计值可以看出（表5），2016年秋季B1、B2和F2群体中，果刺大小多基因遗传方差分别为0.001 1、0.003 2和0.006 3；多基因遗传率分别为40.06%、65.91%和79.21%，环境方差占表型方差的值分别为59.94%、34.09%和20.79%。在2017年春季的B1群体中多基因遗传方差为0.004 9，多基因遗传率为71.13%，环境方差占表型方差的28.87%；B2群体的多基因遗传方差为0.005 2，多基因遗传率为72.46%，环境方差占表型方差的27.54%；F2群体的多基因遗传方差为0.004 9，多基因遗传率为71.25%，环境方差占表型方差的28.75%。由此可见，该群体中果刺大小的多基因遗传率较高，无主效基因存在，受环境影响相对较小。在遗传育种上，应将早代选择和高代选择相结合。在基因定位策略选择上不宜利用F2世代分离群体进行定位，结合高代回交群体进行基因定位效果可能会更好。

表4 CNS5×RNS4 杂交组合果刺大小的一阶遗传参数估计值（C-0模型）

表5 CNS5×RNS4 杂交组合果刺大小的二阶遗传参数估计值（C-0模型）

3 结论与讨论

主基因+多基因混合遗传模型是由盖钧镒等提出的数量性状遗传分析方法，在大豆（刘阳 等，2016）、小麦（李树华 等，2017）、水稻（郑燕 等，2011）、黄瓜（曹明明 等，2018）、油菜（汪文祥等，2016）、胡麻（化青春 等，2016）等多种作物的遗传研究中得到了广泛的应用。本试验利用主基因+多基因混合遗传模型分析法，对2016年秋季和2017年春季2个生长季节的6世代群体P1、F1、P2、B1、B2和F2的黄瓜果刺大小的遗传规律进行了初步分析。结果表明，F1的果刺大小介于两亲本之间。F2分离群体果刺大小表现为无明显分组的连续变异，基本符合正态分布，属于数量性状。其遗传模型符合C-0模型，即加性-显性-上位性多基因混合遗传模型，多基因加性和显性效应均为正向，多基因遗传力相对较高，存在多基因联合效应，且微效基因数目较多，受环境影响也相对较小。连续两季的F2多基因遗传率分别为79.21%和71.25%，多基因遗传率较高且相差不大；与2016年秋季结果相比，2017年春季B1和B2群体的多基因遗传率更高，且差异不大。这可能与2017年春季群体较大，变异相对稳定有关，相应地，所得结果也更可靠。在遗传育种上，应将早代选择和高代选择相结合。在基因定位方面不宜利用F2分离群体进行定位，结合高代回交群体或者利用存在主效基因的群体定位果刺大小相关基因效果可能会更好。

对比连续两季3个分离群体B1、B2和F2的果刺大小变化范围（表1），可以发现，2016年秋季几乎没有出现大于亲本P1和小于亲本P2的极端表型值，而2017年春季有个别大于亲本P1的极端表型值。一方面，可能是由于随着种植群体的加大，果刺大小的极端值出现的几率增大；另一方面，也可能是由于春季温度较高，使得分离群体出现极端值的几率增大，可见环境对试验结果的影响也不容忽视。

黄瓜果刺随着前期果实的快速生长而同步膨大，至开花当天达到最大，之后不再膨大。但据笔者观察，有的黄瓜品种随着果实发育成熟果刺有变小的现象。黄瓜开花后，在成熟过程中黄瓜的主要生长中心逐渐转向果实的膨大和种子的成熟，大量的养分运往果实或种子用于生长，作为外在保护性器官的果刺不再是主要的生长中心，从而失去了纵向和横向继续生长能力。受外在温度、水分等胁迫的影响，果刺有失水缩小、硬化等现象。果实发育成熟果刺变小的这种现象除与品种、栽培条件有关外，可能也有相应的基因控制该进程。因此选择开花当天鉴定果刺表型结果相对准确。

多基因控制的数量性状受环境的影响较大，不同的栽培环境如温度、湿度等的不同变化会导致较大的差异。2016年秋季群体（图5）的频次分布可能由于群体较小，受极端天气的影响以及分组太大导致统计差异比较大，表现为不是特别典型的正态分布。果刺基座本身就小，有时拍照时的环境光线不稳定，部分照片质量会受到影响，会对部分数据的统计造成较大误差。2017年春季B1、B2和F2群体的频率分布则更倾向于正态分布（图5）。由此可知，群体越大所得结果也相对更可靠。数量性状的表型效应是与环境共同作用的结果，无论其相关基因表现为主效基因还是多效基因，都与环境的互作有关（向道权 等，2001）。

主基因+多基因混合遗传模型是研究数量性状遗传规律的一种有力工具，依据作物表型值分析遗传规律。该体系综合了其他经典遗传学的优势，可以进行单个数量性状基因鉴别研究，包含多种类型，依不同群体使用对应的类型，容易操作，可以区分出数个主基因数量和效应。目前为止最多可预测到两对主效基因和相应的遗传率，但是当群体预测处在微效多效基因区时，与经典遗传学无异，只能预测多基因的遗传效率，却预测不到更多更具体的多基因数量（刘阳 等，2016）；不同群体中，同一性状的不同类型会有不同的表现，这是该模型的局限所在（狄佳春 等，2016）。尽管如此，该模型在多种作物中的广泛使用和所得结果为其数量性状育种的选育时期、QTL基因定位策略的制定提供了重要的参考。对该体系的进一步优化和发展（章元明，2012），增加主效基因的预测数量并提高其预测的准确性和精确性，也会为遗传育种工作者提供更可靠、更精准的数量遗传信息。

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