微生物保藏研究进展

郭佳文 季佳鑫 陈佳明 刘思伯

摘 要：剖析了厌氧氨氧化菌种低温保藏的影响因素，保藏温度对厌氧氨氧化颗粒污泥特性的影响，间歇性饥饿对厌氧氨氧化菌混培物保藏特性的影响。最后指出，厌氧氨氧化菌种低温保藏的条件。

关键词：厌氧氨氧化；保藏条件；条件影响

研究厌氧氨氧化菌混合物的保藏方法的研究有利于环境的进一步净化，而保藏工艺有利于氨氧化菌的保存，以更好的减少污染净化环境，而收集文献的目的是为了更好地证明这种保藏方法的正确性[1，2]。

1.厌氧氨氧化菌低温保藏的影响因素

1.1保藏温度

厌氧氨氧化菌对温度变化比较敏感，在正常进行厌氧氨氧化反应阶段，所需的最佳温度范围是6～43℃。然而保藏厌氧氨氧化菌种时，保藏温度也会影响厌氧氨氧化菌的生存状态及后期恢复活性时的速度，因而选择恰当的保藏温度至关重要[3]。

1.2保护剂

1.2.1海藻糖

海藻糖是生物组织的非特异性天然保护剂，属于非渗透性低温保护剂，可使动植物和微生物等有机体在冷冻、高温、脱水、高渗透压及有毒试剂等环境中仍保持生命活力。可见，低温下添加海藻糖有助于减缓低温损害，但海藻糖的添加量需结合具体保藏条件而具体设定。然而，迄今尚未见海藻糖在厌氧氨氧化菌种保藏中使用的报道。

1.2.2二甲亚砜

DMSO也是一种常见的冷冻保护剂，在常温下其毒性较强，其毒性随着温度的降低而减小，如在低温下（4℃）添加DMSO，可降低其对细胞的毒害作用。DMSO还具有抗凝集作用，可促使单个细胞正常生存。

1.2.3甘油

作为一种常见的冷冻保护剂，甘油的使用在实验室中较常见.它能降低冷冻液的渗透压，减缓细胞受渗透压的胁迫，它还能渗透进入细胞体内来平衡细胞内的水分

1.3保藏时间

保藏时间也会影响菌种保藏效果.所需要的保藏时间不同，相应的保藏方法也有所差别。一般而言，菌体活性会随着保藏时间的延长先下降后趋于稳定，若保藏时间较短时，采用常温保藏法既不会对菌体活性变化产生显著影响，又能节省成本；当保藏时间较长时，低温的选取也需尽可能地实现“双赢”（活性抑制程度不受影响，节约成本）。

1.4基质条件

保藏菌种的培养基如何配制也是值得考虑的部分。硝酸盐作为缓冲剂，在活性恢复时会随着保藏时间的不同出现不同的迟滞效应[4]。有学者也用过蒸馏水和葡萄糖分别作为基质，发现以蒸馏水为基质的效果较好。

进行厌氧氨氧化菌种保藏时，菌种保藏环境（保藏温度、保护剂的选择、基质等）的设定直接关系到细菌的生存状态。在上述诸多保藏方法中，如今广泛应用的是冷冻法，甘油和海藻糖是较为推荐的保护剂，但添加合适浓度的DMSO，菌种活性恢复效果很好。保护剂的使用与保藏温度和保藏时间息息相关，菌种活性恢复效果更是依赖于保藏环境和解冻过程。总之，无论是保藏环境还是解冻处理，都与厌氧氨氧化菌本身的生理特性有关。千篇一律地使用一种保藏方法，以及采用雷同的操作条件均不足取，需结合实际现有条件具体分析[5]。

2.保藏温度对厌氧氨氧化颗粒污泥特性的影响

实验首先通过 HRT 调控进水基质负荷培养厌氧氨氧化颗粒污泥，并采用 KHCO3 和 NaHCO3 交替提供无机碳源。然后分别在–40 ℃、4 ℃、（27±4） ℃室温和 35 ℃条件下避光保藏。结果表明，NaHCO3 可代替 KHCO3 作为厌氧氨氧化菌生长的无机碳源。相比于其他保藏温度，4 ℃保藏能够较好地维持生物量和生物活性，同时能较好地维持颗粒污泥的沉降性能、颗粒污泥和细胞结构完整性。同时，颗粒污泥胞外聚合物中蛋白质与多糖的比值 （PN/PS） 和血红素不能有效指示保藏过程中颗粒污泥沉降性能和活性的变化，而生物活性与胞溶程度呈负相关[6]。

3.间歇性饥饿对厌氧氨氧化菌混培物保藏特性的影响

3.1间歇性饥饿对厌氧氨氧化菌混培物的危害

大于长期性饥饿，且亚硝态氮浓度越高产生的危害越大。采用 R1（4℃）、R2（4℃并每隔10 d换一次NO2- /NH4+为1.32的基质）、R3 （4℃并每隔10 d换一次 NO2-/NH4+为1.63的基质）3种方法保藏的厌氧氨氧化菌混培物，活性均先快速下降后趋于稳定，但三者的衰减速率始终为 R1< R2

3.2厌氧氨氧化菌混培物活性与血红素 c含量有直接相关性，保藏过程中的血红素 c含量衰减速率与活性衰减速率趋于一致.无外界颜色干扰时厌氧氨氧化菌混培物颜色可直观反映其活性和血红素c 含量，但有外界干扰时颜色与活性和血红素 c含量间无任何相关性[7]。

3.3饥饿保藏过程中，高浓度亚硝酸盐条件下厌氧氨氧化菌体死亡自溶现象更严重，但厌氧氨氧化菌混培物的颗粒结构及其富含的胞外多聚物增强了其抵抗外界不利因素的能力。

目前为止，有关厌氧氨氧化菌保藏的报道还仅见低温和常温的保藏方法。 对于动物来说，早有实验表明动物短期饥饿后其食欲会增大，如果间歇性饥饿对于厌氧氨氧化菌来说有同样功效的话那将是环境工程界的幸事，尤其对于厌氧氨氧化菌的保藏来说。

结论：厌氧氨氧化菌为自养菌，当环境中存在有机物时，其基质亚硝酸盐易受反硝化菌的竞争。厌氧氨氧化菌对环境条件 （如水质、温度） 敏感，对毒性物质适应能力较差。迄今为止，厌氧氨氧化工艺的应用仅局限于少数几种低 C/N 和易生物处理的废水。因此研究最适宜的菌种保藏条件对厌氧氨氧化工艺的推广应用具有重大的现实意义。总之，无论是保藏环境还是解冻处理，都与厌氧氨氧化菌本身的生理特性有关。千篇一律地使用一种保藏方法，以及采用雷同的操作条件均不足取，需结合实际现有条件具体分析。

参考文献：

[1]汪彩华[6]，郑平，胡安辉.硝化产物对硝化细菌混培物保藏特性的影响[J].中国环境科学，2011，31（10）：1663-1668.

[2]汪彩华，郑平，蔡靖等.厌氧氨氧化菌混培物保藏方法的研究[J].中国环境科学，2013，33（8）：1474-1482.

[3]李祥，鄭宇慧，黄勇等.保存温度及时间对厌氧氨氧化污泥活性的影响[J].中国环境科学，2011，31（1）：56-61.

[4] 唐崇俭，郑平，陈建伟.流加菌种对厌氧氨氧化工艺的影响[J].生物工程学报， 2011，27（1）： 1-8.

[5]于英翠，高大文，陶彧等.利用序批式生物膜反应器启动厌氧氨氧化研究[J].中国环境科学，2012，32（5）：843-849.

[6]唐崇俭，郑平，陈建伟，等.基于基质浓度的厌氧氨氧化工艺运行策略[J].化工学报，2009，60（3）：718-725.

[7]张蕾，郑平，胡安辉.铁离子对厌氧氨氧化反应器性能的影响[J].环境科学学报，2009，29（8）：1629-1634.