影响甘啤5号大麦幼胚愈伤组织诱导及植株再生的 因素研究

张正英 李静雯

摘要：以幼胚为外植体，观察激素、培养基等对甘啤5号啤酒大麦出愈率、分化率及绿苗率的影响。结果表明，在愈伤诱导过程中，诱导培养基CIM2（MS+1.25 mg/L CuSO4+1.00 mg/L VB1+250.00 mg/L肌醇+690.00 mg/L脯氨酸+1 g/L 水解酪蛋白+187.50 mg/L谷氨酰胺+25.00 mg/L天门冬酰胺+2.00 mg/L 2，4-D+0.50 mg/L dicamba）出愈率最高（88.4%），CIM1（MS+1.25 mg/L CuSO4+1.00 mg/L VB1+250.00 mg/L肌醇+690.00 mg/L脯氨酸+1 g/L水解酪蛋白+2.50 mg/L dicamba）与CIM2上形成的愈伤质量优于CIM3（MS+1.25 mg/L CuSO4+1.00 mg/L VB1+250.00 mg/L 肌醇+690.00 mg/L 脯氨酸+1 g/L水解酪蛋白+3.00 mg/L 2，4-D）；相同培养基中，dicamba对甘啤5号的出愈率的作用优于2，4-D。不同分化培养基的分化效率不同，DCM1的分化率高（45.8%），优于DCM2。甘啤5号的幼胚愈伤组织诱导频率及绿苗分化率均较高，可作为啤酒大麦遗传转化的受体材料。

关键词：甘啤5号；啤酒大麦；幼胚；愈伤诱导；植株再生

中图分类号：S512.3 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2018）10-0005-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.10.003

Effect of Combined Application of Fertilizers on Yield and Water Use Efficiency of Brassica campestris

ZHAO Zhongliang 1， LUO Zhaoxia 1， E Shengzhe 2， YANG Zhiqi 1

（1. Tianshui Institute of Agricultural Sciences， Tianshui Gansu 741000，China； 2. Institute of Soil Fertilizer and Water-saving Agriculture， Gansu Acadamy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：With Brassica campestris cultivar Tianyou 8 as indicators， the combination ratios of organic fertilizer and nitrogen， phosphorus and potassium fertilizer on Yield and water use efficiency of Brassica campestris were studied. The results show that fertilization can obviously improve the yield and water use efficiency of Brassica campestris， and the effect of combined application of organic fertilizer and nitrogen， phosphate and potassium fertilizer is more significant. Under the treatment of chicken manure 7 500 kg/hm2（dry weight）， urea 150 kg/hm2， ordinary superphosphate 75 kg/hm2， potassium sulphate 75 kg/hm2， the winter survival rate of Brassica campestris is 98.56%， 9.37% higher than the control； the yield is 2 575.04 kg/hm2， 550.00% higher than that of the control； and the water use efficiency is 5.80 kg /（hm2·mm）， 504.17% higher than the control. The yield and water use efficiency of all treatments with organic fertilizer are better than non-organic fertilizer， indicating that combined application of organic manure and NPK fertilizer is the best choice to improve the yield and water use efficiency of Brassica campestris.

Key words：Brassica campestris；Combined application；Yield；Water use efficiency；Winter survival rate

大麥是世界上主要的粮食、酿酒原料和饲料作物[1 ]。利用转基因和基因编辑等现代生物技术将成为优质高产专用大麦新品种培育的有效途径，而建立高效的组织培养再生体系是其重要的基础工作。大麦是开展遗传转化较早的单子叶作物，已有研究表明，基因型是影响大麦组培再生的重要因素，不同基因型再生能力差异很大，大部分品种难以通过组织培养获得再生植株[2 ]；外植体的不同对大麦再生能力也有很大影响。国内外相继开展了通过幼胚、成熟胚、幼穗或顶端分生组织等不同外植体建立大麦植株再生体系的研究，结果表明，幼胚具有较好的培养再生能力，是建立大麦遗传转化体系最适宜的外植体；成熟胚作为外植体具有取材方便、数量大、保存期长等优点，能极大地方便转基因技术的应用，以成熟胚为外植体建立高效的再生体系的研究受到重视。

以幼胚和成熟胚为外植体的植株再生体系因受基因型和激素类型等的影响，存在着诱导分化率低等诸多问题，目前多数大麦转基因工作只能在一些模式品种上进行，而这些模式品种已不再是生产中的主推品种，甚至不是理想的亲本材料，极大地限制了转基因技术在大麦育种上的应用效果。甘啤5号是甘肃省农业科学院选育的二棱皮大麦啤酒酿制专用品种，具有早熟、抗倒伏、抗干旱、耐盐碱、抗干热风和抗条纹病等优良性状，种皮薄、粒径大、千粒重高、发芽势强，属优质高产广适性啤酒大麦品种，有良好的推广应用前景，在甘肃、云南等省区种植面积较大[3 - 7 ]。我们对影响甘啤5号幼胚和成熟胚愈伤组织诱导及植株再生培养的影响因素进行了研究，试图建立适宜甘啤5号特定基因型的高效再生體系，为啤酒大麦遗传转化和品质改良等分子育种研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试大麦品种为甘啤5号、Golden promise、Schooner ，其中甘啤5号种子由甘肃省农业科学院啤酒大麦育种课题组提供，Golden promise、Schooner由英国JIC提供。

1.2 培养基

试验所用培养基共4类，即愈伤诱导培养基（CIM）、继代培养基（CSM）、分化培养基（DCM）和生根培养基（RCM）。各种培养基成分见表1。所有培养基加入30 g/L麦芽糖和4.2 g/L琼脂粉，调pH至5.8，于121 ℃、0.1 MPa压力下高压蒸汽灭菌20 min。

1.3 试验方法

大麦种子播种于大田，密切观察生长发育情况，开花后12～14 d从田间采幼穗剥取幼胚。其他田间管理与一般大田相同。

1.4 取材及组织培养方法

1.4.1 取材及灭菌 大麦开花后12～14 d（幼胚长约1.0～1.5 mm）时剪下幼穗，剥出籽粒，用70%的酒精表面消毒1 min，再用0.1% 的升汞（HgCl2）消毒8 min，无菌水冲洗3～4次。

1.4.2 幼胚处理及脱分化培养 在超净工作上用镊子剥取幼胚，剥去胚轴后盾片朝上接种于3种愈伤组织诱导培养基，每个直径9 cm的培养皿接入40～50枚幼胚，3次重复，在25 ℃下暗培养。

1.4.3 愈伤组织的继代与分化培养 将出愈的愈伤组织转接到继代培养基上，每14 d继代1次，培养条件同上。将诱导出的愈伤组织转移至分化培养基DCM 1或DCM 2上，在人工培养箱中于24 ℃、3 000 lx白光下，12 h光照、12 h黑暗培养。

1.4.4 再生苗的生根培养及移栽 分化再生苗长至2～3 cm时，将其转移至生根培养基上进行生根培养，在25 ℃光培养4～5 d。待生成新根，试管苗长出3叶1心后，室内打开瓶口，炼苗2～3 d。冲洗干净根部的培养基，将苗移栽到装有营养土（蛭石与大田土按质量比1∶1配制）的营养钵中。长出1片心叶后带基质移栽至大田。

1.5 统计与分析

幼胚接种于愈伤组织诱导培养基21 d后，统计不同品种的愈伤组织诱导率，并以愈伤组织的大小和表观（色泽，紧实度以及胚性区域比例）来判断其质量。良好的愈伤组织色泽光亮，淡黄，爽脆，质地紧密，表面有瘤状突起。分化培养28 d后，统计绿苗分化率。

出愈率=（诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数）×100%

绿苗率=（分化出绿苗数/接种的愈伤组织数）×100%

2 结果与分析

2.1 激素对幼胚愈伤组织诱导的影响

高的愈伤组织诱导率是大麦植株再生的必要前提，不同激素种类对不同大麦基因型幼胚愈伤组织诱导效果不同。通过表2可以看出，甘啤5号在3种诱导培养基上均能形成愈伤组织，但诱导率有明显差异，愈伤组织质量也不同。甘啤5号在诱导培养基CIM1和CIM2上形成的愈伤组织颜色淡黄、质地紧密，颗粒状的胚性愈伤多，且生长较快，说明dicamba对甘啤5号愈伤组织的形成有显著的正效应，其效果优于2，4-D。不同激素培养基对甘啤5号的诱导效果由大到小依次为dicamba+2，4-D（88.36%）、dicamba（49.31%）、2，4-D（35.19%）。同时也表明，已知培养特性良好的大麦基因型Golden promise和Schooner无论在2，4-D或dicamba单独或者联用的情况下均表现出很高的愈伤组织诱导率，且差异不明显。同时发现，dicamba对愈伤组织的质量有明显影响，形成的愈伤组织色泽光亮，质地紧密，颗粒状的胚性愈伤多。

2.2 基因型对幼胚愈伤组织诱导的影响

从表3可以看出，甘啤5号的出愈率为57%左右，明显低于Golden Promise、Schooner 97%以上的出愈率，3个品种之间的幼胚愈伤组织诱导效果相差很大，再一次证实愈伤组织的诱导是由基因控制的可遗传性状。甘啤5号的幼胚愈伤组织诱导效果虽然低于Golden Promise和Schooner，但出愈率也达到了50%以上，也表现出较好的培养特性，可以应用于一般遗传转化试验。

2.3 基因型对幼胚愈伤组织分化的影响

将幼胚愈伤转入分化培养基14 d后，一些淡黄色的愈伤组织表面渐渐长出绿原基，其中一部分能继续分化形成绿苗，生长发育成植株；而另一些则只能生根，难以继续分化成苗。不同大麦基因型分化能力不同（图1），Golden Promise与甘啤5号在DCM1上的分化率分别为93.6%与45.8%，Golden promise的分化率明显高于甘啤5号，可见大麦幼胚诱导的愈伤组织分化成苗具有较强的品种特异性。Golden Promise在DCM1、DCM2不同分化培养基上的分化率差异不大。甘啤5号、Schooner 2个品种在DCM1上的分化率明显高于DCM2，说明除基因型对植株再生起重要作用外，分化培养基中添加不同激素也对植株再生产生重要影响。

2.4 生根培养及移栽

3种基因型在不同分化培养基上得到的再生苗生长情况基本一致，在生根培养基上培养都能产生根系，炼苗移栽后生长差异不大。

3 小结与讨论

本研究表明，基因型无论在幼胚愈伤组织的诱导培养还是幼胚愈伤组织的分化培养中起着主导作用，不同基因型的诱导率与分化率相差很大，同一基因型的诱导培养与分化培养表现也并不总是一致。在脱分化培养中，Golden Promise和Schooner的愈伤组织诱导率均很高，对不同激素培养基的反应差别不大。而甘啤5号愈伤组织诱导率低于Golden Promise和Schooner的诱导率，且dicamba的诱导效果明显优于2，4-D的诱导效果。在愈伤组织分化培养中，3个基因型在分化培养基上的反应基本一致，即在同时加入6-苄基腺嘌呤和萘乙酸的培养基的分化培养效果优于在只加入6-苄基腺嘌呤的培养基上的效果。但Golden Promise依然保持了良好的分化培养特性，而Schooner的表现甚至不如甘啤5号。从总体结果来看，甘啤5号在脱分化培养和愈伤组织分化培养中表现出较好的培养特性，说明本试验设计的愈伤组织诱导培养基和愈伤组织分化培养基适合甘啤5号的培养，对以甘啤5号幼胚为外植体的遗传转化体系的建立奠定了基础。

dicamba是禾谷类作物愈伤组织诱导培养基中使用较为广泛的一种激素。Castillo等[8 ]的研究表明，相对2，4-D而言，dicamba利于胚性愈伤组织的诱导和维持以及提高愈伤组织分化潜能。本研究同样表明dicamba对大麦愈伤组织的诱导效果优于2，4-D，尽管不同基因型的反应有所不同。

在Dahleen[9 ]和李会勇等[10 ]研究表明，在诱导培养基中提高Cu2+浓度明显提高出愈率和再生率，对啤酒大麦胚性愈伤组织的形成有明显的促进作用。一些关于小麦组织培养的研究同样表明提高Cu2+浓度明显提高绿苗再生率。Purnhauser[11 ]在6种不同Cu2+含量的培养基中进行了再生试验，结果表明在培养基中增加Cu2+含量，植株再生率最高可提高8倍；Purnhauser等[12 ]研究表明，CuSO4显著地增强了小麦分化绿苗的能力，还能刺激根系的形成；AgNO3虽能促进绿苗分化，却抑制了小麦根系的形成。

Nuutila等[13 ]研究表明，胚性愈伤组织形成的早期对有机氮的要求较高，这很可能与水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺等能够显著增加胚性细胞生成比例有关，氮的组成和Cu2+浓度对大麦再生效率的影响是明显的，通过优化这些因素能够改进大麦的再生效率和降低白化苗比例。邢莉萍 等[14 ]在小麦幼胚培养中添加水解酪蛋白、谷氨酰胺等，获得良好的培养效果。本试验在幼胚愈伤组织诱导培养基中增加了CuSO4用量，添加了谷氨酰胺和天門冬酰胺，发现愈伤组织的诱导率明显较高，且形成的胚性愈伤组织也较多，明显提高了绿苗分化率。总之，本研究证明甘啤5号幼胚愈伤组织出愈率及分化率都较高，可作为大麦遗传转化的受体。

参考文献：

[1] 徐银萍，潘永东，包奇军，等. 啤酒大麦新品种甘啤7号选育报告[J]. 甘肃农业科技，2017（6）：8-11.

[2] 任江萍. 大麦幼胚离体培养条件的建立[J]. 麦类作物学报，2005，25（6）： 25-28.

[3] 包奇军，柳小宁，张华瑜，等. NaCl与NaHCO3+Na2CO3对不同基因型啤酒大麦萌发期胁迫效应的比较[J]. 江苏农业科学，2014，42（10）：92-95.

[4] 包奇军. 早熟抗旱啤酒大麦甘啤5号丰产性稳产性适应性及品质分析[J]. 农业科技通讯，2011（11）：56-58.

[5] 杨春利，周红艳，徐 宁，等. 昆明地区啤酒大麦甘啤5号的应用推广[J]. 农业科技通讯，2014（7）：282-283.

[6] 徐银萍，潘永东，方彦杰，等. 甘啤系列7个啤酒大麦品种在武威市的比较试验初报[J]. 甘肃农业科技，2014（1）：6-8.

[7] 包奇军，潘永东，张华瑜，等. 早熟、抗旱啤酒大麦新品种—甘啤5号[J]. 麦类作物学报，2008，28（3）：542.

[8] CASTILLO A M，EGANA，B，SANZ，et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration from barley cultivars grown in Spain[J]. Plant Cell Reports. 1998，17（11）：902-906.

[9] DAHLEEN L S. Improved plant regeneration from barley callus cultures by increased copper levels[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1995，43（3）：267-269.

[10] 李会勇. Cu2+浓度对啤酒大麦幼胚组织培养与植株再生的影响[J]. 麦类作物学报，2003，23（2）：27-29.

[11] PURNHAUSER L. Stimulation of shoot and root regeneration in wheat （Triticum aestivum） callus cultures by copper[J]. Cereal Research Communication，1991（19）：419-423.

[12] PURNHAUSER L，GYULAI G. Effect of copper on shoot and root regeneration in wheat，triticale，rape and tobacco tissue cultures[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1993，35（2）：131-139.

[13] NUUTILA A M，H M L INEN J，MANNONEN L. Optimization of media nitrogen and copper concentrations for regeneration of green plants from polyembryogenic cultures of barley （Hordeum vulgare L.）[J]. Plant Science，2000（151）：85-92.

[14] 邢莉萍，王华忠，蒋正宁，等. 小麦幼胚再生培养体系优化及优良转化受体基因型的筛选[J]. 麦类作物学报，2008，28 （2）：187-192.

（本文责编：陈 伟）