草莓酒自然发酵过程中的真菌群落分析

张 源，孙晓璐，兰 伟，张新红，刘文福，王士华

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳236037；2.阜阳职业技术学院，安徽 阜阳 236031；3.阜阳市鸿福农业科技股份有限公司，安徽 阜阳 236127；4.阜阳市颍泉区农产品质量安全检验检测站，安徽 阜阳 236000）

果酒的发酵本质上是以酵母菌为主导的微生物代谢过程。早期的研究认为，非酿酒酵母属酵母耐酒精能力弱，发酵力弱，产酒精能力低，产生大量的醋酸，因此一直被认为是葡萄酒酿造的有害菌种。但近年来的研究发现，某些非酿酒酵母在发酵过程中可产生一些高级醇、低级脂肪酸和酯类等芳香化合物，使得果酒的气味芬芳，酒体典型性更加突出[1-2]。此外，葡萄表面自然附着的某些霉菌，如：贵腐霉菌（Botrytis cinerea）能赋予葡萄酒更浓郁的果香、花香和烘烤香气，而白粉菌（Erysiphe necator），则会减少香草类化合物的含量，令葡萄酒索然无味[3]。在一些传统的葡萄酒产区，仍然保留了自然发酵的生产方式，且利用野生菌种自然发酵生产的葡萄酒无论在结构、复杂感、香气、地域特色等方面往往均优于纯种酿酒酵母发酵的葡萄酒[4]。这显示出自然发酵在果酒酿造中的独特价值。针对草莓酒的初步研究也发现，单一酵母菌种发酵的草莓酒酒质纯净，但存在口感淡薄的品质缺陷，而自然发酵的草莓酒香气更丰富、典型，还具有更加复杂的有机酸组成，口感更醇厚，但口感偏酸[5]。这表明，草莓酒的多菌种自然发酵对果酒品质既有积极影响，也有消极的一面。因此，如何利用自然发酵的优势，弥补或改善自然发酵与单一酵母菌种发酵的缺陷，尚需深入研究。为此，阐明草莓酒自然发酵过程中的微生物群落组成、结构及演替变化规律，分析其与酒体特征之间的联系，是了解自然发酵草莓酒酒体特征形成机制的基础。由于目前尚无相关研究的系统报道，本研究利用高通量测序技术，分析了草莓酒自然发酵过程中的真菌群落结构，并探讨了主要优势菌群及其与草莓酒品质的关系，以期为后续研究提供理论依据与参考。

1　材料与方法

1.1　材料

草莓品种为‘甜查理’，于2017年4月24日采收于阜阳市颍泉区闻集镇文福草莓种植专业合作社。该批草莓于2016年8月15日定植，2016年10月20日扣棚，进行保护地栽培，直至2017年5月。白砂糖（市售）；灭菌10 L发酵罐；控温培养箱；无菌取样管（20 mL）；移液枪（10 mL）。

1.2　发酵方法

大田采摘的新鲜草莓运输至阜阳市鸿福农业科技股份有限公司，经破碎机（合肥大汉酿酒设备有限公司）破碎打浆，皮渣分离后，装入无菌发酵罐。转移至实验室后，加入鲜重20%的白砂糖，25℃条件下自然发酵。在超净工作台内分别采集发酵初期（第2天）、发酵中期（第6天）、发酵末期（第10天）的发酵样品。样品设两个平行（初期B011、B012；中期 B021、B022；末期 B031、B032），所取样品-20℃冻藏保存，后送往上海派森诺生物科技股份有限公司武汉分公司进行测序，测序平台为Illumina Miseq。

1.3　高通量测序及分析

原始数据处理：使用MiSeq测序仪进行2×300 bp的双端测序。运用QIIME软件（v1.8.0）识别疑问序列，检查并剔除嵌合体序列。

调用UCLUST序列比对工具，对前述获得的序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分。随后，根据每个OTU在每个样本中所包含的序列数，构建OTU在各样本中丰度的矩阵文件（即OTU table）。

对于每个OTU的代表序列，在QIIME软件中使用默认参数，通过将OTU代表序列与真菌的ITS序列的数据库（UNITE数据库，Release 5.0）的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息。

而后根据OTU划分和分类地位鉴定结果，获取每个样本在各分类水平的具体组成，分析不同发酵时期样本的真菌群落组成结构及群落组成的动态变化。并在属的分类水平上分析可能对草莓酒品质产生重要影响的关键真菌类群。

2　结果与分析

2.1　高通量测序结果

对稀释曲线如图1的分析显示，随着测序数量的增加，稀释曲线逐渐趋于平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新OTU。基本可以反映草莓酒发酵过程中的绝大多数真菌信息。

2.2　草莓酒自然发酵过程中的真菌群落分析

2.2.1　门、纲、目、科分类水平的对比分析

利用高通量测序技术，在草莓酒自然发酵醪液中共检测到7个菌门，包含29个纲，70个目，127个科，195个属的真菌。但仍有较多类群未能鉴定（unidentified）或未能确定（Incertae sedis）到门、纲、目、科分类水平。图2列出了纲、目、科分类水平上，平均丰度（发酵初、中、末期相对丰度平均值）高于1%的主要真菌类群。从图2可以看出，随着发酵的进行，菌群结构呈现单一化趋势。

图1　稀释曲线

在门分类水平上，子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）是主要的真菌类群，在发酵过程中它们占到整个菌群的96.6%～100%，如图2(a)。

纲与目分类水平上的菌群结构相似,见图2(b)和(c)，但发酵初、中、末期的群落结构存在差异。

图2　门、纲、目、科分类水平的真菌菌群落结构

在科的分类水平上，如图2(d)，酵母菌科（Saccharomycetaceae）在发酵初、中期的菌群丰度极低（初期0.0%、中期0.2%～0.4%），表明酵母目中其它非酿酒酵母是草莓酒初、中期发酵的主要动力。但至发酵末期，除锁掷酵母目地位未定科（Incertae sedis）相对丰度无明显变化外，其他分类类群相对丰度均大幅降低，酵母菌科（Saccharomycetaceae）成为绝对优势菌群（82.1%～84.2%），表明酿酒酵母是中后期发酵的主要动力。

2.2.2　属分类水平的菌群结构及发酵过程中的对比分析

表1列出了菌群中平均丰度大于0.5%的优势属。可以看出，发酵初期，Pilidium（20.2%～24.5%）、子囊菌门未确定属（unidentified）（22.5%～26.1%）是主要的优势属，但随着发酵的进行，其相对丰度迅速下降至1%以下。而葡萄孢霉属（Botrytis）、假丝酵母属（Candida）随着发酵的进行，丰度逐渐升高，成为发酵中期的优势属（37.2%～43.8%、13.8%～15.5%），但发酵末期，相对丰度又迅速降低至1%以下，而酵母菌属（Saccharomyces）（高通量测序鉴定为Saccharomyces cerevisiae）（82.1%～84.2%）成为发酵末期的绝对优势菌群。

如表1所示，酵母目中丰度较高的有5个属，即：酵母菌属（Saccharomyces）、假丝酵母属、未确定属（f__Dipodascaceae；g__unidentified）、毕赤酵母属（Pichia）、亚罗酵母属（Yarrowia）。从它们发酵过程中相对丰度的变化可以看出，假丝酵母属、未确定属（f__Dipodascaceae；g__unidentified）、毕赤酵母属、亚罗酵母属是草莓酒初期发酵的主要动力。此外，发酵初期丰度较高的非酿酒酵母还有掷孢酵母属（Sporobolomyces）、锁掷酵母目（Sporidiobolales）未知属（unidentified）、隐球酵母属（Cryptococcus）、布勒掷孢酵母属（Bullera），其相对丰度的变化也显示出发酵过程中非酿酒酵母与酿酒酵母之间明显的群落演替现象。

表1　属分类水平上的主要优势菌群及其结构

2.2.3　发酵初、中、末期属水平的分类学组成差异分析

由于菌群相对丰度无法准确反映不同发酵阶段的菌群差异，为进一步分析发酵初、中、末期的菌群差异，使用Mothur软件，调用Metastats[6]的统计学算法，对属水平的各个分类单元在发酵初、中、末期之间的序列量（即绝对丰度）差异进行两两比较检验。结果显示，发酵中期(B02)与初期（B01）、发酵末期（B03）与初期（B01）、发酵末期（B03）与中期（B02）分别有 14个属、20个属、6个属的序列量存在显著性差异（P＜0.05）。其中，酵母菌属发酵中期与初期的绝对丰度无显著差异，但发酵末期与中期、末期与初期差异显著，表明酵母菌属在发酵中期至末期存在显著的菌群增殖。葡萄孢霉属与假丝酵母属在发酵初、中、末期绝对丰度均有显著差异，表明它们在发酵初期至中期存在显著的菌群增殖，但中期至末期存在显著的菌群衰亡。Pilidium在发酵中期与初期、末期与初期的绝对丰度存在显著差异，表明其在发酵过程中存在显著的菌群衰亡。毕赤酵母属绝对丰度在中期与初期、末期与中期存在显著性差异，表明其在发酵初期至中期存在显著菌群增殖，但中期至末期发生显著菌群衰亡，而隐球酵母属随着发酵的进行，菌群发生持续衰亡。

3　讨论

3.1　草莓酒自然发酵的真菌群落分析

利用高通量测序技术，本研究分析了2017年4月底草莓酒生产季节中，自然发酵过程中的真菌群落组成。结果显示，草莓酒自然发酵醪液中的真菌多样性较高（共计7个菌门，29个纲，70个目，127个科，195个属），但随着发酵的进行，群落内的物种数逐渐减少，群落结构趋于单一，表明自然发酵过程抑制了大多数真菌的生长繁殖。

在门分类水平，子囊菌门、担子菌门、结合菌门是草莓酒自然发酵过程中的优势菌群，这与葡萄酒的研究结果一致[7-8]。但在属分类水平，Pilidium（20.2%～24.5%）、子囊菌门未确定属（unidentified）（22.5%～26.1%）、葡萄孢霉属（8.4%～15.1%）是草莓酒发酵初期主要的优势菌群，这与葡萄酒存在较大差异[8]。

研究显示，与葡萄酒酿造有关的酵母大约有20个属[9]，包括尖端酵母（Hanseniaspora/Kloeckera）、红酵母（Rhodotorula）、假丝酵母等，其中，尖端酵母最丰富[10]。但本研究显示，发酵初期草莓酒中尖端酵母丰度极低，而以假丝酵母为主，这与葡萄酒也存在很大差异。

此外，本研究发现，发酵初期酿酒酵母的丰度很低（0.0%，即不足0.1%），且草莓酒发酵过程中非酿酒酵母与酿酒酵母的群落演替发生在第6天以后，相较于葡萄酒的自然发酵[7-8]是一个相对缓慢的过程，这很可能与其初期极低的数量基数及发酵液较高起始糖分的抑制有关。因此，非酿酒酵母对草莓酒的风味形成可能发挥着更为重要的作用。

3.2　草莓酒自然发酵过程中的菌群动态及其与果酒品质的关系

由于发酵初期的菌群结构基本代表了草莓果实表面自然附着的真菌类群，它们主要通过后期生长过程中的生理代谢底物及产物对酒体品质产生影响。菌群动态变化直观反映了其在发酵过程中的生存与生理代谢状态，因此，可以很好的指示其与酒体品质之间的联系。

本研究显示，尽管Pilidium与未确定属（unidentified）是发酵初期的优势菌群，但随着发酵的进行，它们发生了快速的菌群衰亡，表明其难以适应发酵初期较高的含糖量、逐渐升高的酒精度或厌氧环境而迅速消亡，因此，它们对草莓酒的风味可能影响甚微。

葡萄孢霉属是草莓酒发酵中的主要优势菌群（高通量测序鉴定为Botrytis carolinina），其在发酵中期至末期发生显著的菌群衰亡，可能是发酵末期的厌氧环境及高酒精度对其产生了强烈抑制作用。但由于其在发酵初期至中期存在显著的菌群增殖，其代谢产物必然会对酒体产生影响。葡萄孢霉属中研究较多的是Botrytis cinerea，其感染葡萄果实后，会导致糖分的浓缩，从而赋予发酵醪液较高的起始糖度，可以酿造风味独特的贵腐葡萄酒[11]。对受到感染的葡萄酒发酵醪液中微生物多样性研究发现，菌群中的微弱发酵酵母（如：Kloeckera、Candida）与醋酸菌显著高于未被感染的葡萄酒发酵醪液[12-13]。在本研究中，草莓酒发酵醪液中的葡萄孢霉并非Botrytis cinerea，而是一种在黑莓与草莓中新发现的灰霉菌[14-15]。由于目前对该菌研究很少，其对草莓酒品质的影响尚不清楚。但本研究中较高丰度的假丝酵母菌及自然发酵草莓酒中较高的醋酸含量[5]显示出Botrytis与微弱发酵酵母及醋酸菌之间可能存在协同关系。

假丝酵母是草莓酒发酵中的另一个优势菌群。其在发酵中期至末期存在显著的菌群衰亡，可能与其是一种好氧型酵母有关。但由于其在发酵初期至中期存在显著的菌群增殖，与草莓酒的品质也存在密切关联。研究发现，该类非酿酒酵母与酿酒酵母进行顺序或混合发酵均显示出高产甘油或产酯增香的效果[16-21]。但也有研究发现，假丝酵母还能产生大量2,3-丁二醇，当这种物质浓度过高时能产生黄油、奶酪气味[20]。上述研究表明，草莓酒发酵液中较高丰度的假丝酵母菌很可能与自然发酵草莓酒口感更为醇厚，有机酸种类较多，香气更丰富[5]的酒体特征存在密切关系。

本研究显示，发酵初期的非酿酒酵母菌是早期发酵的主要动力。菌群差异分析显示，隐球酵母在发酵初、中、末期存在较显著的菌群衰亡，而假丝酵母与毕赤酵母在发酵初期至中期存在显著菌群增殖。这表明，假丝酵母与毕赤酵母可能是发酵初期主要的产酒酵母。研究显示，毕赤酵母可为酒体带来更多的酯类，以及挥发性酚类物质，如4-乙基苯酚、4-乙基-2甲氧基苯酚等，这些酚类物质在适宜的浓度下可增加酒的复杂度，但过量会产生刺鼻的异味[20]。此外，毕赤酵母多数能以甲醇为唯一碳源生长代谢，对降低酒体中的甲醇含量具有一定作用[22]。这表明，本研究中的毕赤酵母可能与草莓酒风味之间同样存在密切关系。

掷孢酵母属是草莓酒中丰度较高的非酿酒酵母，菌群差异分析显示，其在发酵过程中的丰度无显著性差异，表现出相对稳定的菌群状态。尽管一般认为该类酵母与酒类发酵无关[9]，但研究显示，该属中的一些种可以产生酯类物质，如具有桃子、芒果及草莓果香的γ-癸内酯[23-24]，以及脂肪酸（亚油酸、亚麻酸等）[25]、可作为酒类增香剂的β-葡糖苷酶[26]等。此外，该属大多数菌株都能产生色素（如类胡萝卜素）[27]。因此该类非酿酒酵母可能与草莓酒的香气、颜色等感官品质存在一定关系。

4　小结

总之，本文利用高通量测序技术，本研究初步阐明了2017年4月底自然发酵草莓酒中的真菌群落结构与动态变化。分析显示，Pilidium、子囊菌门未确定属（unidentified）、葡萄孢霉属（Botrytis）是草莓酒自然发酵过程中的主要优势菌群。假丝酵母属（Candida）、隐球酵母属（Cryptococcus）、毕赤酵母属（Pichia）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、亚罗酵母属（Yarrowia）是主要的非酿酒酵母。其中，葡萄孢霉属、假丝酵母属、毕赤酵母属与草莓酒的理化及感官品质可能存在较为密切的关系。