益气固表丸对COPD模型大鼠水通道蛋白mRNA表达的影响

金　晶，马　欢，王　晶，李风森

(新疆医科大学1中医学院，乌鲁木齐　830011；2第一附属医院中医内科，乌鲁木齐　830054；3附属中医医院肺病科，乌鲁木齐　830000；4新疆维吾尔自治区呼吸病研究重点实验室，乌鲁木齐　830002)

·中医中药·

益气固表丸对COPD模型大鼠水通道蛋白mRNA表达的影响

金晶1,2，马欢3，王晶4，李风森3

(新疆医科大学1中医学院，乌鲁木齐830011；2第一附属医院中医内科，乌鲁木齐830054；3附属中医医院肺病科，乌鲁木齐830000；4新疆维吾尔自治区呼吸病研究重点实验室，乌鲁木齐830002)

摘要：目的研究益气固表丸对慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)模型大鼠肺组织中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4、5mRNA表达的影响。方法采用烟熏+脂多糖(LPS)气管内滴注方法建立COPD模型大鼠，造模成功后，将60只鼠龄为8 w的SPF级雄性Wistar大鼠随机分为3组，分别为：空白组、对照组和实验(益气固表丸)组,每组20只，空白组和对照组大鼠给予生理盐水灌胃，实验组大鼠给予益气固表丸相应剂量的水溶液灌胃，2次/d，连续12 w。采用Buxco系统检测各组大鼠肺功能吸气峰流速( Peak Inspiratory Flow，PIF)、呼气峰流量( Peak Ex-piratory Flow，PEF)及每分钟通气量( Minute Volume，MV)，采用苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin HE)染色法观察大鼠肺组织形态学改变，RT-PCR方法检测大鼠肺组织中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4、5mRNA表达的变化。结果与空白组比较，对照组大鼠肺功能PIF、PEF和MV下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与对照组比较，实验组大鼠HE染色的炎症细胞浸润情况减轻，支气管管腔直径变宽，差异有统计学意义(P<0.01)；与空白组比较，对照组大鼠肺组织 AQP-1、AQP-4、AQP-5mRNA 表达下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与对照组比较，实验组大鼠肺功能PIF、PEF及MV均升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与空白组比较，实验组大鼠肺组织AQP-1、AQP-4、AQP-5mRNA表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论益气固表丸能够改善 COPD模型大鼠的肺通气功能，升高大鼠肺组织中 AQ P-1、AQP-4和AQP -5蛋白表达。

关键词：益气固表丸；COPD模型大鼠；水通道蛋白

中图分类号：R965

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2018)05-0649-04

要探索建立普通学生普及性地参与校园足球的强制机制，这是输送专业足球人材和提高整体学生身体素质的最基础性的保证。如进一步细化、完善足球课的教学大纲，让学生主动参与学习和训练；进一步地完善足球课堂伤害事故的预防和善后工作，制定相关保险法律和法规；制定并推广实行校园内部级别的适合普通学生的足球等级制度(健身型的)，大力推广班级、校际的各种、各级足球联赛；制定各种相关的奖励制度来引导和鼓励学生及家长对校园足球的参与和支持。简单地说，就是把校园足球和学校体育的各项活动完美的结合起来，互相促进，最终形成系列、完整的，由广大学生积极参与的，成效显著的制度和政策。

回归分析是将非确定性变量之间的关系用能够确定的函数关系表达出来。应用SPSS对体系中具体的7个影响因素进行相关性分析，通过相关性分析结果进行回归分析，明确网购客户物流配送满意度的3个显著影响因素，证明研究的有效性。

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.027

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金青年科学基金(2015211C157)

作者简介：金晶(1981-)，女，在读博士，主治医师，研究方向：呼吸病的中医临床诊治。

通信作者：李风森，男，博士，主任医师，教授，博士生导师，研究方向：中西医结合呼吸病研究，E-mail:fengsen602@163.com。

本文引用：金晶，马欢，王晶,等.益气固表丸对COPD模型大鼠水通道蛋白mRNA表达的影响[J].新疆医科大学学报,2018,41(5):649-652.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.027

EffectsofYiqigubiaopillonexpressionofaquaporinmRNAinCOPDrats

JINJing1,2，MAHuan3，WANGJing4，LIFengsen3

(1CollegeofTraditionalChineseMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2InternalMedicineDepartmentofTCM,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi, 830054,China;3PulmonaryDepartment,theAffiliatedTraditionalChineseMedicineHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China；4XinjiangUygurAutonomousRegionKeyLaboratoryofRespiratoryDiseaseResearch,Urumqi830002,China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of Yiqi gubiao pill on expression of Aquaporin(AQP)1,4and 5 mRNA in Chronic obstructive pulmonary disease(COPD)rat model.MethodsCOPD was induced by LPS injection and CS inhalation,60 SPF male Wistar rats at 8 weeks old were divided randomly into 3 groups:Blank group,Control group and Treatment(Yiqi biao pill)group(n=20 for every group).Blank group and Control group rats were fed saline lavage twice a day.Trail group rats were fed with Yiqigubiao solution twice a day as well.After 12 weeks,Wistar rat pulmonary function testing Buxco analysis system was used to examine lung function,such as Peak Inspiratory Flow(PIF),Peak Expiratory Flow(PEF),and Minute Volume(MV).HE staining was used to observe lung tissue pathology morphology,and RT-PCR method was used to detect expression of Aquaporin(AQP)1,4,5 mRNA in the lung tissue of rats.ResultsCompared with the Blank group,PIF,PEF and MV in the Control group were all decreased,and the difference was statistically significant(P<0.01).Compared with the Blank group,the expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 mRNA in lung tissues of rats decreased in the Control group,and the difference was statistically significant(P<0.01),Compared with the Control group,lung function indicators:PIF,PEF and MV in the Treatment group were all increased,and the differences were statistically significant(P<0.01).HE staining showed that the infiltration of inflammatory cells in Treatment group was significantly less than the Control group.The narrowing of the bronchial lumen was significantly improved,the diameter of the lumen was significantly wider.Compared with Model group,the expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 mRNA in the Treatment group was increased,and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionYiqi gubiao pill can improve the pulmonary ventilation function in rats of COPD,and escalate protein expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 in lung tissues of mice.

Keywords:Yiqi gubiao pills;chronic obstructive pulmonary disease(COPD)rat model;aquaporin

气道黏液高分泌状态是慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)发病过程中的一个关键环节，高黏蛋白含量增多，致使痰液黏稠，不易咳出，导致反复感染[1]。水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是细胞膜转运蛋白，广泛存在于生物组织的内皮细胞和表皮细胞膜上，与肺泡液体的转运、气道表面液体的调整、气道湿化及鼻咽部分泌物的产生有关，AQP代谢失常是气道黏液高分泌状态的主要因素[2-3]，纠正AQP代谢失调对气道高反应的影响，成为研究COPD预防和治疗的切入点[4-5]。益气固表丸是以“培土生金”为治则治疗COPD的常用中成药，由党参、炒白术、茯苓、陈皮、法半夏、生薏苡仁、浮小麦、紫苏子、蜜款冬花、黄芩、伊贝母、蜜枇杷叶、防风共13味中药组成，取“益气为健运脾气、固表为补益肺气”之意，能够有效改善证属肺脾气虚证COPD患者咳嗽痰多等呼吸道症状[6-7]，方中党参为君药，合白术、茯苓、半夏及陈皮以行 “二陈汤”之理气和中燥湿之功效，辅以贝母止咳化痰，薏苡仁淡渗利湿，浮小麦及黄芩以滋阴敛汗而清肺之虚热，紫苏以祛风胜湿固表，余药以清利肺气，诸药共参，以行补肺气、化痰湿之效。本研究探究益气固表丸对COPD模型大鼠呼吸道黏液分泌的影响，检测大鼠肺组织中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4及5mRNA表达，为益气固表丸的进一步临床应用和开发提供实验依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物取SPF级鼠龄8 w的雄性Wistar大鼠60只，由新疆医科大学实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK(新)2011-0004，实验单位使用许可证号SCXK(新)2011-0001]。饲养环境模拟自然昼夜条件，温度(21±2)℃，湿度40%～50%，自由饮水，体质量(200±50)g。

1.2试药益气固表丸购自新疆医科大学附属中医医院中心药房(新疆制药厂，批号20121212)，脂多糖(Lipopolysaccharide LPS，美国Signa公司)，雪莲过滤嘴香烟(新疆卷烟厂，烤烟型，焦油量13mg，烟气烟碱量1.1mg，烟气一氧化碳量13mg)，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒(美国Invitrogen公司，批号 C11733-038)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司，批号 15596-026)，M-MLV First-Strand Synthesis Kit反转录试剂盒(美国Invitrogen公司，批号 C28025-032)，RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3仪器自制动物熏吸箱(60cm×50cm×40cm)，PLY3211型Wistar大鼠全身暴露型无创肺功能检测分析系统(美国Buxco Electronics公司)，U-CMAD3 型显微镜(日本Olympus公司)，GX51型全自动图像分析系统(日本Olympus公司)，YP102N型电子天平(上海天平仪器厂)，Milli-Q型纯水处理仪(美国 Millipore公司)，-80℃低温冰箱(德国 Thermo公司)，5418/5418R型高速台式离心机(德国 Eppendorf公司)，Thermal cycler C1000型深孔PCR 仪(美国BIO-RAD公司)。

1.4COPD动物模型的建立及评价方法采用烟熏(CS)联合弹性蛋白酶(LPS)气管内滴注方式建立COPD大鼠模型[8]，将大鼠放置于自制动物熏吸箱，烟雾浓度 450～500bpm进行熏烟，每次30min，每次间隔3h，每12小时更换烟盒1次，并于大鼠气管内滴注LPS 0.2mg /kg体质量，连续12 w。造模第一天和最后一天(第84天)，分别称取大鼠体质量后放入检测室(传感器)，采用Wistar大鼠肺功能检测Buxco系统检测大鼠肺功能吸气峰流速(Peak Inspiratory Flow，PIF)、呼气峰流量(Peak Ex-piratory Flow，PEF)和每分钟通气量(Minute Volume，MV)，与空白组大鼠比较，以上指标下降幅度>30%即为COPD模型成功。按照随机数字表法将大鼠分为空白组大鼠(n=20)、对照组(n=20)、实验(益气固表丸)组(n=20)。按照人与动物间体表面积折算等效剂量公式[9]折算相应剂量，实验组大鼠每日灌药量为513mg/kg体质量，空白组和对照组大鼠每天灌胃0.9%生理盐水6.6mL，实验组大鼠灌胃益气固表丸水溶液6.6mL，每天2次，所有大鼠在给药期间正常喂食,灌胃12 w后处死，取出肺组织，备用。

1.5病理标本的制作取每组大鼠左肺组织，在垂直于支气管的肺矢状面最大周径处取材，取厚约5mm的肺组织，剪成面积为1.5cm2左右的小块，浸入2mL的4%多聚甲醛溶液中固定，用PBS缓冲液洗涤，并浸泡在固定剂24h后，石蜡包埋，将标本切成3～4μm并加工用于HE染色。

1.6肺组织AQPmRNA的检测取每组大鼠右肺组织100mg，依据Trizol试剂说明书提取组织总RNA，PCR试剂盒反转录合成cDNA并扩增目的基因，引物由上海生工生物技术有限公司合成。反应总体系为25μL。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，拍照并读取灰度值，分析AQP1、AQP4、AQP5 mRNA转录水平变化情况，见表1。

表1　AQP1、AQP4、AQP5 引物序列表

2　结果

2.1大鼠肺组织形态学观察空白组大鼠支气管结构及肺泡结构清晰，支气管未见明显收缩，未见明确炎症细胞浸润，气道上皮排列整齐，管腔规则。对照组大鼠支气管及肺泡组织结构紊乱，部分结构消失，支气管黏膜可见大量炎症细胞浸润，支气管出现收缩的现象，管腔变窄，气道上皮排列不整齐，甚至出现断裂的情况。实验组较对照组大鼠支气管炎症细胞浸润情况减轻，支气管收缩好转，管腔变窄情况改善，管腔直径变宽，见图1。

图1　大鼠肺组织HE染色结果(×200)

2.2各组大鼠肺功能比较与空白组比较，对照组大鼠PIF、PEF 和 MV降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与对照组比较，实验组大鼠PIF、PEF、MV升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3各组大鼠肺组织中AQP-1、AQP-4、AQP-5的mRNA表达比较与空白组比较，对照组大鼠肺组织中AQP-1、AQP-4、AQP-5 mRNA表达降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与对照组比较，实验组大鼠肺组织中AQP-1、AQP-5 mRNA表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)，AQP-4mRNA无变化，差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

2.4AQP-1、AQP-4和AQP-5mRNA表达与肺功能的相关性分析各组大鼠肺组织中 AQP-1、AQP-5 蛋白表达与大鼠PIF、PEF和MV指标均呈负相关(r分别为-0.835 4、-0.7642、-0.7524)，差异有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠肺组织中AQP-4mRNA表达与大鼠 PIF、PEF 和 MV 均呈负相关(r分别为-0.245 5、-0.368 8、-0.376 8)，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2　各组大鼠肺功能指标的比较

注:与空白组比较，*P<0.01;与对照组比较，△P<0.01。

表3　各组大鼠肺组织中AQP-1、AQP-4、AQP-5表达的影响

注:与空白组比较，*P<0.01;与对照组比较，△P<0.01。

3　讨论

COPD证属中医学“肺胀”范畴，“痰饮蕴肺”是在“肺胀”发展过程的重要证候[10]。现代中医学者将“整体观”、“辨证观” 与多种组学信息相结合，建立系统生物学与中医证候相结合的“系统-系统”的研究[11]。有学者[12-13]认为高分泌是“痰饮”的物质基础，使用健脾益肺化痰方，通过抑制“ILl3-pSTAT6-MUC5AC”信号通路改善 COPD大鼠气道黏液高分泌状态。詹少锋等[14]发现益气化痰方能够抑制COPD模型小鼠Muc5ac和 AQP -5的蛋白表达，认为“肺主通调水道”与现代研究对 COPD在细胞免疫、炎症及黏液高分泌状态的病理本质认知是相一致的。祝小惠等[15]应用“从肠论治”法促进COPD模型大鼠肺组织AQP s mRNA的表达，改善气道炎症及表面液体的调节功能。尚立芝等[16]应用爱罗咳喘宁方上调COPD模型大鼠支气管组织AQP5、抑制MUC5AC 基因表达，改善局部气道湿化作用。

本研究探讨慢性气道炎症环境下“痰饮”的物质基础，发现COPD模型大鼠肺功能下降的同时肺组织中AQP-1、AQP-4及AQP-5mRNA表达降低，说明AQP-1、 AQP- 5mRNA表达降低可能引起的气道内水转运功能下降，在炎性因素的刺激下容易导致气道黏液分泌过多，产生气道阻塞。益气固表丸能够使AQP-1、AQP-5mRNA表达升高，促进呼吸道水转运功能，调节呼吸道液体转运，减少痰液产生，减轻气道高分泌状态，减少气道阻塞，从而起到降低气流受限的作用。

[收稿日期：2017-11-10]

(本文编辑施洋)