肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白的筛选及验证

许 阳，杨 震，李春笋，李彦芹，梁志欣

解放军总医院 呼吸内科，北京 100853

肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis related protein 1，LCMR1)基因是解放军总医院呼吸科实验室首先发现并克隆的一种功能基因[1]。课题组前期研究发现，LCMR1基因与肿瘤密切相关，特别是在肺癌的发生、发展、转移中可能发挥着重要作用[1]。LCMR1基因功能和分子机制尚不十分明确，研究LCMR1基因在肺癌发生、发展中的作用和机制，探索有效的基因诊断与治疗方法，对于延长肺癌患者的生存期和提高肺癌患者的生活质量具有十分重要的理论意义和临床应用价值。寻找新基因的相互作用蛋白，通过其相互作用蛋白的功能，推测新基因的功能，是新基因功能研究的重要手段之一。本实验采用酵母双杂交技术初步筛选LCMR1相互作用蛋白，采用融合蛋白沉降技术和免疫共沉淀技术在体外和细胞内进行验证，为LCMR1基因功能研究提供线索和分子基础。

材料和方法

1 质粒 pGBKT7质粒购自美国Clontech公司，质粒有卡那霉素的抗性基因，有酵母转化标记TRP1。pCL1质粒(阳性对照载体)购自美国Clontech公司。pGBKT7-LCMR1质粒、pCMV-Myc-LCMR1质粒、pGEX-5T-LCMR1质粒由本实验室前期构建。pCMVMyc载体购自美国Clontech公司，pcDNA3.0-flag载体购自美国Invitrogen公司，pGEX-5T载体购自美国Amersham公司。pcDNA3.0-flag-DEK质粒由美国Michigan University的Marcovitz教授惠赠。

2 菌株及细胞 AH109酵母菌株购自美国Clontech公司，菌株含4个报告基因HIS3、LacZ、ADE2和MEL1及转化标记LEU2和TRP1。大肠埃希菌DH5α购自北京天根生物公司；人肺癌95D细胞及人胚肾293细胞由本实验室保存。

3 试 剂 TRIZOL购 自 美 国Invitrogen公 司，MATCHMAKER试剂盒购自美国Clontech公司，酵母转化系统购自美国Clontech公司。SuperFect转染试剂购自德国Qiagen公司，T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒购自美国Promega公司；PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。GST结合树脂购自德国Novagen公司，TNT T7 Quick体外翻译转录试剂盒购自美国Promega公司。[35S]-甲硫氨酸购自北京亚辉公司。Flag抗体购自美国Sigma公司，Myc抗体购自英国Abcam公司，β-actin抗体购自美国SantaCruz公司。

4 肺癌95D细胞双链cDNA文库片段的合成 采用TRIzol方法提取95D细胞总RNA，紫外分光光度仪检测提取95D细胞总RNA的光密度值，鉴定RNA的纯度。使用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。采用SMART技术，以肺癌95D细胞总RNA为模板进行逆转录反应，将95D细胞总RNA逆转录成cDNA的第一条链，通过长距离PCR(LD-PCR)方法扩增出双链cDNA(ds cDNA)，将95D细胞cDNA片段与文库载体相连，构建95D细胞文库。

5 诱饵质粒在酵母中的表达及诱饵质粒自激活及毒性作用的检测 将诱饵质粒pGBKT7-LCMR1转化入酵母菌AH109，从SD/-Trp平板上挑取1个生长良好的菌落，提取酵母菌总蛋白，使用SDSPAGE电泳和Western blot检测诱饵质粒在酵母中的表达；依照小规模酵母转化实验方法，将pGBKT7空载质粒、pGBKT7-LCMR1质粒及作为阳性对照的pCL1质粒分别转化入感受态酵母菌AH109，三组转化产物分别涂于培养板SD/-Trp/X-α-gal、培养板 SD/-Trp/-Ade/X-α-gal、培养板 SD/-Trp/-His/X-α-gal，30℃倒置培养 3 ～ 6 d，观察克隆生长及显色情况，判断质粒是否存在自激活作用；分别将转化pGBKT7-LCMR1质粒的酵母菌和转化pGBKT7空载质粒的酵母菌接种于在50 ml SD/-Trp/Kan液体培养基中，30℃过夜培养，分别检测二组的OD600值，检测LCMR1对宿主菌是否有毒性。

6 诱饵质粒及文库共转化酵母筛选阳性克隆 将线性化质粒pGADT7、pGBKT7-LCMR1质粒及人肺癌95D细胞cDNA文库片段共转化酵母菌AH109，将转化菌液按1∶10、1∶100、1∶1 000的比例稀释，分别取少量不同稀释浓度的酵母菌转化菌液，涂布于SD/-Leu平板和SD/-Leu/-Trp平板上培养，计算文库的共转化率及重组率。将剩余的转化菌均匀涂布于50块150 mm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养板，30℃倒置培养3 ～ 8 d。以共转pGBKT7-Lam及pGADT7-RecT为阴性对照组，共转pGBKT7-53及pGADT7-RecT为阳性对照组。

7 阳性克隆的鉴定及生物学信息学分析 采用重复划线培养方法去除假阳性克隆。提取阳性克隆酵母菌中的质粒，将质粒转化至大肠埃希菌DH-5α中，扩增后提取文库质粒。将提取的阳性文库质粒与pGBKT7-LCMR1质粒共转入酵母菌AH109，以共转文库质粒和空载质粒pGBKT7为阴性对照，回复验证文库质粒与诱饵质粒的相互作用。回复验证为阳性的单个文库质粒，测序其插入片段，测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对。

8 免疫共沉淀实验 在含有10% BCS的RPMI1640培养液中培养人肺癌95D细胞，传代至10 cm培养皿中。采用Superfect转染试剂，将DEK质粒(pcDNA3.0-flag-DEK)及LCMR1质粒(pCMV-Myc-LCMR1)共转染95D细胞，转染48 h后收获细胞，提取细胞总蛋白。将蛋白上清与2μg的抗体antimyc混合，在4℃环境下，轻缓摇动孵育3 h，加入Protein A/G agarose珠子40μl，4℃环境下，轻缓摇动孵育8 h，使抗体与Agarose偶联。4℃离心并用裂解液洗脱珠子3次，加入2×SDS的上样缓冲液，100℃条件下处理5 min，上样于10%SDS-PAGE胶，电泳转膜后，使用Flag抗体进行Western blot实验，检测复合物中有无Flag-DEK。分别以单独转染LCMR1质粒(pCMV-Myc-LCMR1)和单独转染DEK质粒(pcDNA3.0-flag-DEK)作为实验对照组。

9 GST与GST-LCMR1融合蛋白的表达和纯化分别将pGEX-5T(GST载体)与pGEX-5T-LCMR1(GST-LCMR1融合载体)转化到DH-5α感受态细菌，取适量菌液涂布于LB/Amp+平板，37℃倒置培养过夜。加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG，于20℃诱导4 h，取5 ml菌液，离心后弃上清，加入适量PBS液悬浮细胞，离心后弃上清。加入1/10菌液体积的RIPA裂解缓冲液，冰上裂解30 min，用超声裂解仪破碎细菌，离心后取上清，部分上清上样于SDS-PAGE凝胶，电泳转膜后进行免疫印迹检测GST与GST-LCMR1表达情况。将剩余细菌裂解蛋白上清与GST琼脂糖珠混合后室温(30℃)晃动培育1 h，裂解液洗脱杂蛋白，使用Western blot检测GST蛋白及GST-LCMR1融合蛋白纯化情况。

10 DEK蛋白及DEK功能区蛋白体外转录翻译以DEK质粒DNA为模板，采用PCR法分别扩增DEK功能区N端和C端编码片段，酶切后分别将两个扩增片段连接至空载体pcDNA3.0-flag，构建pcDNA3.0-flag-DEK(N端)功能区质粒及pcDNA3.0-flag-DEK(C端)功能区质粒。提取DEK质粒，DEK(N端)功能区质粒及DEK(C端)功能区质粒。采用TNT T7 Quick体外翻译转录试剂盒，在体外将3种质粒DNA分别转录翻译成DEK蛋白，DEK的N端功能区蛋白和DEK的C端功能区蛋白，并用35S标记蛋白。

11 GST pull down实验 取25μl 35S标记的DEK全长蛋白分别与100μl GST蛋白(对照组)及100μl GST-LCMR1融合蛋白(实验组)混合，室温(30℃)孵育1 h，离心后弃上清，使用裂解液反复清洗混合物。试管内加入20μl SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5 min，冷却到室温后，取上清上样到10% SDS-PAGE凝胶，加样进行电泳。干胶后压片，放射自显影技术鉴定LCMR1与DEK是否有相互作用。将35S标记的DEK的N端功能区蛋白、DEK的C端功能区蛋白分别与GST、GST-LCMR1融合蛋白进行Pull down实验，研究LCMR1与DEK相互作用区域。

结 果

1 肺癌95D细胞总RNA及ds cDNA文库片段鉴定人肺癌95D细胞总RNA的浓度为0.95μg/μl，OD260/OD280值 为 1.88，OD260/OD230的 值 为 2.47，RNA有较好纯度。1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳显示RNA完整性较好，提取的总RNA可用于cDNA文库的构建。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，双链cDNA PCR产物(图1第2条泳道)有一条弥散条带，为250 ～ 6 000 bp，符合构建文库的要求。

2 诱饵质粒pGBKT7-LCMR1转化酵母菌及其融合蛋白表达 诱饵质粒pGBKT7-LCMR1转化酵母菌后，使用Western blot检测酵母菌总蛋白，结果显示分子量40 kU处有一条蛋白条带，与LCMR1融合蛋白分子量大小一致，表明pGBKT7-LCMR1融合蛋白在酵母中成功表达。

3 pGBKT7-LCMR1质粒的自激活检测与宿主毒性检测 转化pCL1质粒(阳性对照组)的酵母菌在平板SD/-Leu/X-α-Gal上长出3 mm蓝色菌落，转化pGBKT7空载(阴性对照组)的酵母菌和转化pGBKT7-LCMR1质粒(实验组)的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal培养平板上长出约3 mm的白色菌落，在SD/-Trp/-Ade/X-α-gal及SD/-Trp/-His/X-α-gal培养板上无菌落生长。以上结果证明，pGBKT7-LCMR1诱饵质粒和空载pGBKT7质粒均未发生自激活作用。转化pGBKT7空载质粒的酵母菌和转化pGBKT7-LCMR1质粒的酵母菌的OD600值，分别为1.057和1.098。两者的生长速率无明显区别，表明诱饵质粒pGBKT7-LCMR1对宿主酵母菌无毒性作用。

4 阳性克隆的初筛与鉴定 以营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)筛选共转化pGBKT7-LCMR1质粒、pGADT7-Rec质粒及95D细胞cDNA文库片段的AH109酵母菌阳性克隆，共获得20个阳性候选克隆。计算文库重组效率为1.2×106(＞1×106)，共转化效率为6×105(＞5×105)，达到实验要求的标准。经重复划线验证和回复法验证去除假阳性克隆，最终获得6个阳性克隆与LCMR1存在相互作用。阳性克隆质粒测序结果与NCBI的BLAST数据库比对，得到6个基因编码蛋白(DEK、RPL29、GNG5、CCAR1、LGMN及G3BP1)与LCMR1存在相互作用。选取其中与肿瘤关系最为密切的DEK蛋白进行后续验证。

5 免疫共沉淀实验 将pCMV-Myc-LCMR1质粒及pcDNA3.0-flag-DEK质粒共转染人胚肾293细胞，使用抗体Myc行免疫共沉淀，使用抗体Flag行Western blot实验，结果显示实验组检测到了DEK的存在(图2)，阴性对照组没有检测到DEK。将上述实验以相同条件重复进行3次，得到相同结果。实验表明LCMR1蛋白与DEK蛋白可以特异结合，两种蛋白在细胞内有相互作用。

6 GST蛋白及GST-LCMR1融合蛋白的表达与纯化 使用12.5%SDS-PAGE检测蛋白GST及融合蛋白GST-LCMR1在大肠埃希菌中表达后经琼脂糖珠纯化情况，结果显示(图3)在第3条泳道26 kU大小处有单一的蛋白条带，与蛋白GST分子量大小一致。在第2条泳道47 kU大小处有单一的蛋白条带，与GST-LCMR1蛋白分子量大小一致。提示GST蛋白及GST-LCMR1融合蛋白表达及纯化成功。

7 DEK蛋白、DEK的N端功能区蛋白及DEK的C端功能区蛋白的体外转录翻译 体外转录翻译DEK蛋白、DEK的N端功能区蛋白及DEK的C端功能区蛋白，并用放射性35S标记蛋白。运用放射性自显影的方法进行检测，实验结果显示DEK蛋白、DEK的N端功能区蛋白及DEK的C端功能区蛋白成功表达，蛋白的分子量及表达量符合实验要求。

8 LCMR1蛋白与DEK蛋白的GST pull-down实验在GST-LCMR1与DEK共同孵育的实验组，观察到一条特异性蛋白条带(图4A右)，与阳性对照组DEK蛋白大小一致，提示混合物中有DEK。阴性对照组没有观察到相应条带。实验表明LCMR1与DEK可以在体外特异性结合。在GST-LCMR1蛋白与DEK的N端功能区蛋白共同孵育的实验组，观察到一条特异性蛋白条带(图4B右)，与阳性对照组DEK的N端功能区蛋白大小一致，提示混合物中有DEK的N端功能区蛋白。阴性对照组没有观察到相应条带。实验证实LCMR1和DEK的N端功能区蛋白可以在体外特异性结合。在GSTLCMR1蛋白与DEK的C端功能区蛋白共同孵育的实验组(图4C右)，没有观察到与阳性对照组DEK的C端功能区蛋白大小一致的蛋白条带，提示混合物中没有DEK的C端功能区蛋白。实验证实LCMR1蛋白和DEK的C端功能区蛋白在体外没有特异性结合。

图1 肺癌95D细胞双链cDNA琼脂糖凝胶电泳图1：Marker； 2：肺癌95D细胞双链cDNAFig. 1 Lung cancer 95D cell doublestranded cDNA agarose gel electrophoresis result1: Marker; 2: Lung cancer 95D cell double-stranded cDNA

图2 免疫共沉淀方法验证LCMR1与DEK在细胞内的相互作用Fig. 2 The interaction of LCMR1 and DEK in vivo examined by CO-IP assay

图3 蛋白GST及蛋白GSTLCMR1的表达及纯化结果1: Marker; 2: GSTLCMR1; 3: GSTFig. 3 Purification of protein GST and protein GST-LCMR11: Marker; 2: GSTLCMR1; 3: GST

图4 LCMR1蛋白与DEK蛋白的GST pull-down实验放射自显影图A: LCMR1蛋白和DEK全长蛋白的体外相互作用； B:LCMR1蛋白和DEK的N端功能区蛋白体外相互作用； C:LCMR1蛋白和DEK的C端功能区蛋白体外相互作用Fig. 4 Direct interaction of LCMR1 and DEK in vitro examined by GST pull-down assayA: The interaction between LCMR1 and DEK; B: The interaction between LCMR1 and N-terminal constructs of DEK; C: The interaction between LCMR1 and C-terminal constructs of DEK

讨 论

随着环境污染的加重以及吸烟人口的增加，原发性支气管肺癌(简称肺癌)的发病率逐年上升[2-3]。肺癌发生、发展的相关机制，成为了肺癌研究的重要课题。大量研究证实，肺癌的发生和发展是多基因参与的复杂过程[4-5]。肺癌相关基因的发现为肺癌研究奠定了基础，然而目前这些基因还并不能完全阐明肺癌的机制。因此，进一步寻找肺癌发病过程中起关键作用的基因，并对其功能进行系统研究，对于揭示肺癌发生、发展的分子机制意义重大。

肺癌转移相关蛋白1是解放军总医院呼吸科实验室利用差异显示聚合酶链反应技术，从具有高转移性的人肺癌细胞株95D细胞中克隆出的新基因[1]。LCMR1(GenBank登录号AY148462)位于人类染色体11q12.1，分子量约为19 kU。近年来有研究发现LCMR1可能与膀胱癌及结肠癌的发生、发展密切相关[6]，Agaësse等[7]利用大规模RNAi筛选方式研究发现，LCMR1作为重要调控因子参与了Tspan8介导的黑色素瘤侵袭过程。呼吸科实验室前期研究发现，LCMR1在非小细胞肺癌中过表达，LCMR1表达与肺癌临床分期显著相关[1]。利用RNA干扰技术抑制LCMR1表达能够促进肺癌细胞凋亡[8]。尽管本课题组前期对LCMR1进行了一些初步研究，但目前其生物学功能仍不十分明确，研究LCMR1基因在肺癌发生、发展中的功能和作用机制，对探索有效的基因诊断与治疗方法意义重大。

研究新基因功能的重要手段之一是寻找新基因编码蛋白的相互作用蛋白。本研究首先开展酵母双杂交实验，应用Clontech公司的MATCHMAKER试剂盒构建人肺癌95D细胞cDNA文库。将LCMR1诱饵质粒和文库质粒同时共转化入酵母宿主菌，初步筛选出6种蛋白与LCMR1存在相互作用，分别为DEK、RPL29、GNG5、CCAR1、LGMN及G3BP1。为进一步探讨LCMR1在肺癌中的作用，我们选择初筛结果中与肿瘤密切相关的DEK基因开展后续研究。鉴于酵母双杂交结果假阳性率较高，我们使用免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)及融合蛋白沉降(GST pull-down)技术对酵母双杂交初筛结果进行验证，确认DEK与LCMR1在细胞内和体外均有相互作用。

DEK是一种原癌基因，众多研究发现DEK在多种肿瘤中均有过表达现象[9-10]。DEK的过表达与肺癌的发生和发展密切相关[11-12]，临床分析发现非小细胞性肺癌患者的DEK阳性表达率为47.9% ～67.2%[13]。对DEK功能机制研究提示DEK蛋白是P53蛋白的负调节蛋白，DEK通过p53通路参与调控肿瘤的发生[14-15]。DEK能降低促凋亡基因p53的蛋白稳定性，抑制p53基因转录活性，降低Caspase-3活性[15]。DEK与AP-2α具有相互调节作用[16-17]，DEK与AP-2α协同增强EGFR家族成员HER2(erbB2，NEU)的基因表达[18]。

DEK基因编码蛋白包含有两个结构功能区域：N端功能区(位于68-226氨基酸)及C端功能区(位于309-375氨基酸)[19]。本实验进一步将DEK按功能区截段，使用GST pull-down明确蛋白LCMR1与蛋白DEK的N端功能区在体外发生特异性结合。

本实验证实，蛋白LCMR1与蛋白DEK的相互作用通过与DEK的N端功能区结合得以实现，DEK的N端功能区与细胞凋亡密切相关。LCMR1与DEK相互作用在细胞凋亡中的确切作用及分子机制，两者相互作用对下游凋亡基因有何调控，有待后续研究揭示。

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