右美托咪定对A549细胞缺氧／复氧损伤时细胞凋亡及CHOP的影响*

罗梓垠，高 慧，项冰倩，邱晓晓，戴雍月△，王万铁△

（1.温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所，浙江 温州325035；2.湖北省中西医结合医院病理科，武汉430015）

肺缺血／再灌注损伤（lung ischemia／reperfusion injury，LIRI）是个复杂的病理生理过程，主要表现为再灌注后肺血管阻力增加、肺水肿、肺泡损伤及微血管通透性增加，严重影响患者预后［1-2］。CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）是C／EBP转录因子的家族成员之一，是内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的一个特异转录因子。CHOP主要分布于细胞质中，正常情况下含量很低。但当ERS发生时，CHOP会大量表达，过量表达的CHOP会诱导细胞凋亡［3］。本实验室前期研究发现，LIRI能激活ERS，活化CHOP凋亡通路，导致小鼠肺组织细胞凋亡。通过RNA干扰使CHOP进行基因沉默，LIRI程度减轻，提示抑制ERS相关通路是治疗LIRI的有效作用靶点之一［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一种新型的麻醉类辅助用药，能与α2肾上腺素受体结合发挥镇静、镇痛作用，有研究表明Dex能减轻多种器官的缺血／再灌注损伤［5］。本研究体外模拟LIRI方法建立A549（起源于肺泡II型上皮细胞系）细胞的缺氧／复氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）损伤模型，旨在观察Dex对A549细胞H／R损伤时细胞凋亡和CHOP表达的影响及可能机制，以期为Dex临床治疗LIRI提供充分的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

F12K培养基和胎牛血清（Gibco），右美托咪定（江苏恒瑞医药股份有限公司），CCK-8试剂盒（日本同仁），TUNEL检测试剂盒（Roche），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物科技有限公司），Trizol（Invitrogen），逆转录试剂盒、PCR试剂盒（Fermentas Life Science），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），一抗：兔抗GAPDH多克隆IgG抗体（杭州贤至生物科技有限公司），CHOP、caspase-3、Grp78（Cell Signaling Technology），二抗：HRP偶联山羊抗兔IgG二抗（Cell Signaling Technology）。其余试剂均为市售分析纯。

常氧培养箱和低氧培养箱（Thermo），倒置相差显微镜（Olympus），超净工作台（苏净安泰），低温高速离心机（Eppendorf），酶标仪（Biotek），摇床（Thermo），荧光化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司），超低温冰箱（Thermo），梯度 PCR仪（Bio-Rad）。

1.2 A549细胞的培养

在人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞（购于中国科学院细胞库）中加入新配制的含10%胎牛血清的F12K培养液（含糖）。F12K培养液中含100 U／ml青霉素和 100μg／ml链霉素。A549细胞常规置于37℃、5%CO2常氧培养箱中培养。待细胞贴壁达80%以上进行传代，每2 d按1∶3传代，待传代3～4次后用于实验。

1.3 细胞模型的建立

采用随机数字表法，将A549细胞分成4组（n＝10）：常氧培养组（N组），Dex常氧组（D组），缺氧／复氧组（H组），缺氧／复氧+Dex组（HD组）。依据参考文献建立A549细胞H／R损伤模型［6］：将生长至对数生长期的A549细胞的完全培养基更换成无血清的F12K培养基，在常氧培养箱中预处理1 h。然后，将细胞培养液换为无糖的OGD液［7］，并置于低氧培养箱内孵育6 h。之后将OGD液再次更换为无血清的F12K培养基，于常氧培养箱内复氧处理24 h。D组和HD组在造模开始时加入Dex至终浓度 1 nmol／L［8］。

1.4 细胞形态学观察

造模结束后，将A549细胞置于倒置显微镜下观察其生长状况及形态学变化。

1.5 CCK-8法检测细胞活力

用胰酶消化，将A549细胞吹打成细胞悬液，按104cells／well将其接种于96孔板中。每组设6个复孔，且加设空白对照组。接种细胞后，周围一圈加PBS，防止培养液蒸发。置细胞培养箱中培养，待贴壁生长良好后开始造模。从培养箱中取出96孔板，弃去旧培养基，按每孔110μl将CCK-8混合液加入96孔板，避光、37℃孵育30 min，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值。

1.6 TUNEL法检测细胞凋亡

取处于对数生长期的A549细胞，消化后置6孔板内进行细胞爬片，细胞生长良好后进行造模。造模结束后，按TUNEL检测试剂盒说明书进行操作，在光学显微镜下（×100）观察细胞形态，胞核呈棕褐色者为凋亡细胞，每张片至少观察500个细胞，计数每100个细胞中的凋亡细胞数，再取其平均值，得出凋亡指数（apoptotic index，AI）。

1.7 Western blot法检测 A549细胞 CHOP、Grp78、caspase-3蛋白的表达水平

用细胞刮刀收集A549细胞，加入预冷的裂解液100μl（PMSF：RAPI＝1∶100），反复吹打。置于冰上40 min，使其充分裂解。低温离心，取上清液，用BCA法测定蛋白质浓度，绘制标准曲线，样品蛋白配制成2μg／ml，继之将其煮沸变性。配制琼脂糖凝胶进行电泳，转膜至PVDF膜。再将用TBS浸湿的膜放至5%脱脂奶粉中，室温下封闭2 h。TBST漂洗，加入一抗（抗 CHOP／Grp78／caspase-3／GAPDH抗体，CHOP／caspase-3 1∶500稀释，Grp78／GAPDH 1∶1 000稀释），4℃孵育过夜。TBST洗涤7 min×3次，再加入HRP标记的二抗（测定CHOP／Grp78／caspase-3／GAPDH时二抗均以1∶8 000稀释），室温孵育 1 h。TBST洗涤 7 min／次、×3次，滴加发光液，反应 2 min，用荧光化学发光成像系统进行曝光，再用凝胶分析软件分析内参蛋白与目的蛋白吸光度值。

1.8 RT-PCR检测 A549细胞 CHOP、Grp78 mRNA的表达水平

在每组细胞皿里加Trizol充分匀浆，使细胞完全裂解。提取总RNA并测定RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA。引物由上海捷瑞生物工程有 限公司合成，CHOP：Left：5’-CCACTCTTGACCCTGCTTCTC-3’，Right：5’-CTAGCTGTGCCACTTTCCTTT-3’，扩 增 片 段 长 度 246 bp。Grp78： Left：5’-GTCCTATGTCGCCTTCACTCC-3’，Right：5’-AAATGTCTTTGTTTGCCCACC-3’，扩增片段长 度 232 bp。GAPDH： Left：5’-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3’， Right： 5’-TTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3’，扩增片段长度220 bp。采用荧光实时PCR仪进行扩增。PCR参数：94℃，3 min；94℃，30 s；CHOP，52℃／Grp78 59℃／GAPDH 54℃，30 s；72℃，1min；共 33个循环，72℃，5min终止延伸。配制1.5%琼脂糖凝胶，每孔加入5μl PCR产物，电泳条件为100 V，40min，紫外线照射扫描结果并保存。Quantity One软件分析电泳条带灰度值，以目的基因扩增产物密度与GAPDH基因扩增产物密度之比表示目的基因表达水平。

1.9 统计学处理

所有计量数据以均数±标准差（）表示，采用SPSS 17.0统计软件进行分析，并进行正态性检验。多组样本均数间的比较进行方差齐性检验，组间两两比较应用单因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齐性者两两比较采用LSD-t法，方差不齐者两两比较进行Dunnet’t3检验。

2 结果

2.1 Dex对A549细胞形态学的影响

倒置显微镜下观察发现，N组和D组未见悬浮细胞，A549细胞生长良好，胞体透亮，胞核完整。H／R损伤后，H组A549细胞呈不规则多边形生长，细胞发生融合现象，核固缩，胞体变暗；细胞间隙增大，贴壁细胞数减少。与H组比较，HD组A549细胞数增多，细胞形态变化不明显（图1）。

2.2 Dex对A549细胞活力的影响

常氧培养条件下，N组和D组细胞活力的吸光度值分别为 1.358±0.104，1.371±0.046，二者无统计学差异（P＞0.05）。经 H／R损伤后，H组吸光度值为0.752±0.096，与N组比较，吸光度值明显下降（P＜0.01）。经 Dex处理后，与 H组相比，HD组吸光度值上调，为 1.057±0.045，差异有统计学意义（P＜0.01），表明 Dex能增加 A549细胞 H／R损伤后的细胞活力（图2）。

Fig.1 The historical changes of A549 cells in each group under the invertedmicroscope（×100）

Fig.2 The changes of expression of absorbance value and AIvalue in all groups

2.3 Dex对A549细胞凋亡率的影响

在常氧培养条件下，N组和D组AI值分别为3.500±1.080和 4.300±1.494，两者比较无统计学差异（P＞0.05）。经 H／R损伤后，H组 AI值为35.400±3.534，与 N组比较，H组 AI值升高显著（P＜0.01）。经 Dex处理后，HD组 AI值下降为 17.900±3.071，与 H组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），这表明Dex能降低H／R损伤A549细胞的AI值，减少细胞凋亡（图 2，3）。

2.4 Dex对 CHOP、Grp78和 caspase-3蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与 N组相比，D组CHOP、Grp78和caspase-3蛋白表达水平无明显统计学差异（P＞0.05）。经 H／R损伤后，与 N组相比，H组中CHOP、Grp78和caspase-3蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）。经 Dex处理后，HD组 CHOP、caspase-3蛋白水平显著下降，与H组比较差异有统计学意义（P＜0.01，图 4）。

Fig.3 The apoptosis index detected by TUNEL in each group（×100）

Fig.4 The expression levels of CHOP、Grp78、caspase-3 proteins in various groups

2.5 Dex对CHOP和Grp78mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，与 N组相比，D组 Grp78、CHOPmRNA表达水平无明显统计学差异（P＞0.05）。经 H／R损伤后，H组中 Grp78、CHOPmRNA表达水平均明显升高（P＜0.01）。经Dex处理后，与H组相比，HD组 Grp78 mRNA表达上升（P＜0.01），CHOPmRNA表达显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01，图 5）。

Fig.5 The expression levels of Grp78、CHOPmRNA in various groups

3 讨论

肺泡II型上皮细胞是肺泡的重要组成部分，尽管仅占肺泡表面积的5%，但对维持肺泡结构和功能具有重要作用。肺泡II型上皮细胞的凋亡和坏死数量直接决定LIRI的严重程度及预后。由于肺泡II型上皮细胞体外培养较为困难，其性状不稳容易向肺泡I型上皮细胞转化，故很多体外实验研究采用A549细胞来替代肺泡 II型上皮细胞［9］。H／R损伤模型的建立是先对A549细胞进行一定时间的氧糖剥夺，低氧造模时，A549细胞培养液被更换成OGD液，并置于低氧培养箱中进行低氧处理以模拟在体肺组织缺血损伤；随后将OGD液更换成细胞培养液，将培养皿放回常氧培养箱中模拟在体的再灌注损伤，这是国内外研究常用的离体组织器官缺血／再灌注损伤的造模方法之一［8，10］。本研究观察到，造模后H组细胞数量减少、细胞形态发生改变。采用CCK-8法检测细胞活力，与N组相比，H组细胞吸光度值显著下降，细胞活力降低。TUNEL结果显示，与N组比较，H组凋亡细胞数明显增多，AI值升高，提示H／R损伤造模成功。

引起细胞凋亡的因素有很多，如氧化应激、炎症反应、细胞内钙稳态失衡等。有研究发现，细胞凋亡与LIRI有密切联系，且细胞凋亡在LIRI中起到重要作用［11］。ERS是细胞凋亡的途径之一。葡萄糖调节蛋白 78（glucose-regulated protein 78，Grp78）是内质网上3种伴侣蛋白之一，在非应激状态下处于无活性状态。当ERS发生时，Grp78会与3种内质网跨膜蛋白 PERK（protein kinase R like ER kinase）、IRE1（inositol-requiring protein-1）和 ATF6（activating transcription factor 6）解离，使其活化，介导发生未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），与未折叠或错误折叠蛋白结合，维持内环境的稳态［12］。PERK、ATF6及IRE1都能诱导CHOP转录，使细胞内CHOP大量表达，促使细胞凋亡［13］。caspase-3是 Caspase家族中重要的凋亡执行者，是多个凋亡信号通路的一个共同的下游效应酶，其活化是凋亡进入不可逆阶段的标志［14］。本研究表明，N组 CHOP、Grp78、caspase-3蛋白和 CHOP、Grp78mRNA表达均处于较低水平。经 H／R干预后，H组 AI值上调，CHOP、Grp78、caspase-3蛋白和 CHOP、Grp78mRNA的表达水平急速增加，提示H／R损伤会诱发 ERS，导致细胞凋亡。

右美托咪定（Dex）通过多种途径对重要器官发挥一定的保护作用，主要途径有抑制炎症反应、抑制血管收缩、减轻氧化应激水平、增强机体免疫力等［15］，具有广阔的应用前景。袁培根等［16］研究证实，Dex能通过α2受体上调Nrf2核内表达，启动有利基因以对抗氧化作用，从而达到缓解肢体I／R损伤的作用。葛东建等［17］研究发现，Dex预处理能激活p-Akt信号通路减轻急性肺损伤，发挥对肺的保护作用。本研究显示，经Dex干预后，HD组A549细胞Grp78蛋白与mRNA表达增加，其机制可能与Grp78活性增加以促进蛋白折叠，试图恢复内质网功能，抑制内质网应激，发挥保护细胞作用。这亦与调控内质网相关凋亡通路等有密切关系。CHOP信号通路是内质网应激重要途径之一，与H组比较，HD组CHOP、caspase-3蛋白，CHOPmRNA表达水平明显下降，细胞活力增加，细胞损伤程度减轻、凋亡细胞数明显减少。提示Dex能抑制ERS，对抗细胞凋亡，减轻H／R损伤。

综上所述，Dex对H／R损伤A549细胞具有一定的保护作用，其机制可能与减少过度ERS时CHOP表达所引起的细胞凋亡有关。本研究在离体实验中证实Dex对LIRI的保护作用，进一步阐明肺组织细胞凋亡的分子机制，为Dex治疗LIRI提供理论依据。

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