熊果酸对糖尿病小鼠肝损伤的作用及其可能机制*

王旭焘，陈思思，齐敏友

（浙江工业大学药学院药理研究所，杭州310014）

糖尿病除引起心、脑、肾、眼器官的损伤外，其所致的肝损伤日益受到学术界的重视。统计显示，21%～78%的2型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）患者通常伴有肝内脂肪浸润，部分患者可发展为脂肪性肝炎甚至肝硬化［1］。高血糖介导的氧化应激在糖尿病性肝损伤的发生发展中起着关键作用［2］。熊果酸（ursolic acid，UA）是一种五环三萜类化合物，现代药理研究证实，具有降血糖、调血脂、护肝等作用［3-5］。Jang［6］等报道，UA能够通过抑制糖尿病小鼠肝脏多元醇途径，对肝脏起保护用。但是UA是否能够通过降低糖尿病小鼠肝组织氧化应激水平而减轻肝组织损伤，少有报道。本实验通过建立高脂饲料联合链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病小鼠模型，观察UA对肝功能及肝组织氧化应激指标的影响，研究UA对糖尿病小鼠肝损伤的保护作用及其机制，为熊果酸治疗糖尿病性肝损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

链脲佐菌素（HPLC≥98%，美国Sigma公司）；柠檬酸钠缓冲溶液（泽衡生物科技有限公司）；熊果酸（HPLC≥98%，西安开来生物工程有限公司）；高脂饲料（含70%普通饲料，15%蔗糖，15%猪油），血糖仪、血糖试纸（Onetouch ultraeasy，美国Johnson公司）；总胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒（南京建成生物工程研究所）；电子天平（AL104，瑞士 Mettler Toledo公司）；超低温冰箱（702，美国 Thermo公司）；恒温水浴箱（WB22LA，德国 Memmert公司）；多功能酶标仪（Synergy H1，美国 Bio-Tek公司）；倒置荧光显微镜（TI-S，日本Nikon公司）；台式高速冷冻离心机（Biofuge pico，德国 Heraeus）。

1.2 实验动物和模型建立

实验使用雄性ICR小鼠共30只，SPF级，体重（20±2）g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2014-0001。小鼠适应性喂养1周。随机选取20只小鼠高脂饲料喂养6周后，STZ（30mg／kg）腹腔注射连续 5 d，9 d后测空腹血糖，大于 11.1 mmol／L视为糖尿病模型，将其随机分为模型组和熊果酸组（100mg／kg［7-8］），每组 10只；剩余 10只小鼠设为对照组。熊果酸研磨成粉，用生理盐水制成混悬液，超声混匀后灌胃（100 mg／kg），正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃，实验第9周起连续8周。

1.3 一般指标检测

小鼠末次给药后，禁食12 h，称重并测定空腹血糖。

1.4 样本收集

血样本留取：小鼠摘眼球取血，常温静置6 h，4℃离心（3 500 r／min，10 min），取上清，-20℃冰箱保存待用。肝组织样本留取：处死小鼠，迅速摘取肝脏，生理盐水漂洗，取同侧部位肝组织少许，置于4%多聚甲醛溶液中固定。取适量肝脏组织，用冷生理盐水制成 10%均浆液，离心（3 000 r／min，10min），取上清液，-20℃冰箱保存待用。

1.5 生化指标检测

按试剂盒说明书测定总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）。

1.6 病理学检查

肝组织用4%多聚甲醛溶液固定72 h后，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、进行HE染色，400倍光镜下观察。

1.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 5.0软件进行单因素方差分析（One way ANOVA）及Tukey检验进行多组间比较，以均数 ±标准差（）表示。

2 结果

2.1 熊果酸对小鼠一般体征、体重和血糖的影响

对照组小鼠精神良好，毛色光亮，饮食摄水正常，体重逐渐增加。模型组小鼠精神不振，毛色发黄，多饮、多食、多尿，与对照组小鼠相比，16周后体重显著降低（P＜0.01），空腹血糖显著升高（P＜0.01）。熊果酸组小鼠精神较好，毛色较亮，多饮、多食、多尿症状明显改善。与模型组小鼠比较，16周后熊果酸组小鼠体重有所增加，但无统计学差异，空腹血糖显著降低（P＜0.01，表1）。结果表明，熊果酸能够有效降低糖尿病小鼠血糖水平。

2.2 熊果酸对小鼠血清TC、TG含量的影响

相较于对照组小鼠，模型组小鼠TC、TG水平显著升高（P＜0.01）。与模型组小鼠比较，熊果酸组小鼠 TC、TG水平明显降低（P＜0.05，表 2）。提示熊果酸能够有效调节糖尿病小鼠脂质代谢紊乱。

Tab.1 Changes of body weight and fasting blood glucose before and after ursolic acid administration inmice（，n＝10）

Tab.1 Changes of body weight and fasting blood glucose before and after ursolic acid administration inmice（，n＝10）

BW：Body weight；FBG：Fasting blood glucose；UA：Ursolic acid**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs model

Group BW（g ）FBG（mmol／L）0Week 8Week 16Week Control 22.6±2.2 30.3±1.2 40.6±2.8 4.5±0.6 4.8±0.3 4.9±0.5 Model 22.8±2.0 34.7±3.8 28.4±3.9** 4.6±0.6 18.0±1.9** 18.9±3.1**UA 22.3±1.8 34.5±4.0 30.8±2.5** 4.1±0.9 17.8±1.8** 13.3±2.1**＃＃0Week 8Week 16Week

Tab.2 Effects of ursolic acid on level of TC and TG in serum（mmol／L，珋，n＝10）

Tab.2 Effects of ursolic acid on level of TC and TG in serum（mmol／L，珋，n＝10）

TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；UA：Ursolic acid*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs model

Group TC TG Control 2.2±0.5 1.2±0.3 Model 3.5±0.4** 1.9±0.4**UA 2.8±0.4*＃ 1.4±0.2＃

2.3 熊果酸对小鼠血清ALT、AST活性的影响

相较于对照组小鼠，模型组小鼠ALT、AST活性显著升高（P＜0.01）。熊果酸组小鼠相较于模型组小鼠ALT、AST活性有不同程度下降（P＜0.05，P＜0.01，表3）。提示熊果酸能够改善糖尿病小鼠的肝功能。

Tab.3 Effects of ursolic acid on the activity ALT and AST in serum（，n＝10）

Tab.3 Effects of ursolic acid on the activity ALT and AST in serum（，n＝10）

ALT：Alanine aminotransferase；AST：Aspartate transaminase；UA：Ursolic acid*P＜0.05，**P＜0.01 vs control； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

Group ALT（U／L） AST（U／L ）Control 14.4±3.7 12.8±2.9 Model 44.0±7.8** 24.6±3.4**UA 23.1±6.5*＃＃ 19.6±3.0**＃

2.4 熊果酸对小鼠肝组织SOD活性与MDA含量的影响

相较于对照组小鼠，模型组小鼠SOD活力显著降低（P＜0.01），MDA含量显著增多（P＜0.01）。熊果酸组小鼠与模型组小鼠比较，SOD活力明显升高（P＜0.05），MDA含量明显减少（P＜0.05，表 4）。提示熊果酸能够有效增强糖尿病小鼠肝组织的抗氧化功能。

Tab.4 Effects of ursolic acid on MDA and SOD in liver（，n＝10）

Tab.4 Effects of ursolic acid on MDA and SOD in liver（，n＝10）

SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malondialdehyde；UA：Ursolic acid**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs model

Group SOD（U／mg prot） MDA（nmol／mg prot ）Control 117.7±19.1 1.4±0.1 Model 74.5±7.4** 1.8±0.3**UA 97.9±11.1＃ 1.5±0.1＃

2.5 熊果酸对小鼠肝组织结构的影响

HE染色显示，对照组肝小叶结构清晰，肝索排列有序，肝窦规则；模型组部分肝细胞水肿，轻度脂肪变性，门管区可见淋巴细胞浸润。熊果酸组肝细胞排列较为整齐，水肿不明显，未见空泡变性，淋巴细胞少量存在（图1）。提示熊果酸能够延缓糖尿病小鼠肝组织的病变过程。

Fig.1 Effects of ursolic acid on pathological changes（HE×400）

3 讨论

本实验通过高脂饲料联合小剂量STZ腹腔注射的方法诱导制备T2DM小鼠模型。高脂饮食使小鼠体内产生胰岛素抵抗，再通过小剂量STZ腹腔注射破坏部分胰岛β细胞，使其体内胰岛素分泌相对不足，造成T2DM小鼠模型。实验结果显示，模型组小鼠空腹血糖显著升高，表明T2DM模型建立成功。经熊果酸干预后，小鼠空腹血糖明显降低，提示熊果酸具有降血糖的作用。

T2DM常伴有脂质代谢紊乱，高脂血症是糖尿病性肝损伤的常见原因［9］。ALT、AST活性是检测肝功能的常用指标，提示肝脏是否受到损伤。实验结果提示，熊果酸具有调节脂质代谢和改善肝功能的作用，能延缓肝脏的病变进程。

众多研究发现，高血糖介导的氧化应激在糖尿病性肝损伤的发生发展中起着关键作用［2］。当机体内活性氧簇（reactive oxgen species，ROS）生成增加或抗氧化能力减弱时，过剩的ROS与大分子物质发生脂质过氧化反应，形成脂质过氧化物，如MDA等，致使细胞结构和功能发生改变，引起肝细胞损伤［10］。SOD是一种内源性抗氧化酶系，通过抑制自由基生成发挥抗氧化作用，保护肝细胞免受损伤。本实验结果提示熊果酸能降低肝组织的氧化应激水平，提高肝脏抗氧化能力。

综上所述，熊果酸对糖尿病小鼠肝损伤具有保护作用，其机制可能与降血糖、调节血脂、降低肝组织的氧化应激水平，提高肝脏抗氧化能力有关。由于目前针对糖尿病肝脏并发症仍缺乏较好的治疗手段和治疗方法，因此研究熊果酸对糖尿病肝脏并发症的作用机制，对开发中药治疗临床糖尿病肝损伤具有重要的理论意义和实用价值。

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