猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

李婧雅 王德全 袁秀芳 黄华荣

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310000；2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310000）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14～25nm，平均直径17nm，呈对称的二十面体，无囊膜，是目前已知最小的动物病毒之一。根据其致病性、抗原性或基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒1型（PCV1）和有致病性的猪圆环病毒2型（PCV2），前者广泛存在于猪群当中。PCV2是仔猪多系统衰竭综合征（PostweaningMultisyst emicWastingSyndrome，PMWS），猪皮炎、猪增生性坏死性间质性肺炎与肾病综合征（PNDS）的主要病原，PMWS是最早被认识和确认的由PCV2感染所致的疾病。常见的PMWS主要发生在5～16周龄的猪，极少感染乳猪。一般于断奶后2～3d开始发病。PMWS主要以渐进性消瘦、生长迟缓、厌食、精神沉郁、行动迟缓、皮肤苍白、被毛蓬乱、呼吸困难，咳嗽为特征，急性发病猪群中，病死率可达10%，但并发或继发细菌或病毒感染的病死率可达25%以上。血清学调查表明，PCV2在世界范围内流行，给生猪饲养业造成了严重的危害。该病受到各国农业部门的高度重视。近年来猪圆环病毒2型已成为国内外兽医领域的研究热点之一,国内外对此已有很多报道。例如胡晓华等通过间接ELISA方法在安徽、广东、广西等可疑猪群中检测PCV2阳性率分别为100%、48.39%、100%。本研究拟通过Genebank数据库中序列比对法设计特异性引物，并对各项参数进行合理优化，建立一种稳定、灵敏的针对PMWS检测的PCR方法。利用这一方法对来自浙江省不同地区规模猪场疑似患PMWS仔猪的病料进行PCR检测应用，最终为浙江省生猪饲养业的PMWS流行病学提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 材料

实验材料取自浙江地区带有典型PMWS症状病猪的淋巴结、脾脏、肺脏等脏器，-80℃保存备用。确诊的猪伪狂犬病病料（PRV）、猪细小病毒病病料（PPV）作为特异性检测的对照。

TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR纯合试剂盒、病毒DNA提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。实验所需大肠杆菌DH5α、pMD18-T载体购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计和合成

通过比对GenBank数据库中15种PCV2病毒株的基因共有特征及PCV2 ORF2的核苷酸序列，应用Primer Premier软件分别设计了一对特异性引物，该对引物能够特异扩增PCV2中的469bp序列,而同属的PCV1核酸序列则不能扩增出条带。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

上游引物序列为P1：

5’-TCCGCGGGCTGGCTGAACT-3’

下游引物序列为P2：

5’-GGGGGAAAGGGTGACGAACTGG-3’

1.2.2 病料处理及病毒DNA提取

新鲜组织用剪刀剪去脂肪、肌腱等,按1∶5加入PBS液,无菌研磨成匀浆，-70℃冻融3次，4℃，12000rpm离心5min, 取上清。用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA，最后洗脱于50µlTE缓冲液中，于-20 ℃保存。

1.2.3 ORF2基因的PCR扩增

PCR扩增的反应体系为50.0µL，其中：10×Buffer 5.0µL、2.0mM MgCl2 4.0µL、200µM dNTPs 5.0µL、0.1µM PCV2-P12.0µL、0.1µM PCV2-P22.0µL、rTaq DNA ploymerase 0.5µL、DNA 模板 2.0µL。补足 ddH2O 至 50µL。混匀后置与BioradT100 PCR仪，扩增的反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，36 个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存备用。最终PCR产物用1.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.4 PCR条件优化

以病料提取的病毒DNA为模板,设计不同复性温度（52℃-60℃，间隔1℃）、不同引物浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、及1.2μmol/L），分别以上述的反应体系和反应程序进行PCR扩增，比较最终产物的扩增效率。

1.2.5 敏感性测定

用紫外分光光度计测定PCV2 DNA模板的浓度，初始病毒DNA模板浓度约为10ng/µL，用TE缓冲液将混合模板作1∶10系列稀释（10-0～10-6），每个稀释度取2µl作为模板，进行PCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以检测该PCR方法的敏感性。

1.2.6 特异性测定

常规提取非靶DNA，包括PCV1、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）基因组DNA，设置空白对照,用PCV2特异性引物及上述方法进行PCR扩增、电泳，检测该方法的特异性。

1.2.7 重复性检验

用上述建立的PCR反应体系和反应程序对3份不同的PCV2阳性病料DNA分别进行6次重复性试验，检验该方法的重复性和稳定性。

1.2.8 PCR产物的克隆及测序

将病料扩增所得的PCR产物基因片段连接到pUC18载体中，转化DH5α大肠杆菌，用含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养基进行筛选，37℃培养16h后挑取单个白色菌落，置于含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中振荡培养，扩增提取出的质粒提取送上海生物工程有限公司进行测序。测序结果利用NCBI网站的数据库进行比对。

1.2.9 浙江地区PCV2的分子流行病学调查

应用优化建立好的PCR方法对来自浙江不同地区142份疑似PCV2感染病猪进行批量检测，确定最终的感染率。

2 试验结果

2.1 PCV2基因的PCR扩增

以临床病料提取DNA作为模板，经过PCR扩增、电泳后，可见469bp的特异性条带。结果如图1。

图1 PCV2的PCR扩增结果

2.2 PCR条件的优化

经过在52～60℃温度梯度下扩增，结果为在所有温度条件下，均扩增出了目的片段，但52～55℃出现少许非特异性带。以57℃扩增时产物得率最高，故将此PCR反应的退火稳定设置在57℃。

在引物浓度的优化实验中，0.6-1.0μmol/L浓度的引物均可以扩增出469bp大小的目的片段。最终人们确定下来的最佳反应体系为10×buffer 2μL，dNTP（各10mmol/L）0.5μL，Pl、P2 各 0.5μL，Taq DNA 聚 合 酶0.2μL，DNA 模板 2μL，无菌 ddH2O添加至20μL，采用以下反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃1min,35次循环；最后72℃延伸5min。

图2 PCV2敏感性检测结果

2.3 敏感性测定

病料模板DNA经过连续6次的10倍稀释,在上述优化后的条件下扩增，图2结果显示10-5倍稀释后（2pgDNA模板）仍能扩增出预期大小片段，表明其敏感度达到0.1pg/ul浓度，证明该方法具有极高的灵敏度。

2.4 特异性测定

用我们设计的PCV2特异性引物扩增PRV、PPV和PCV1病料模板DNA，电泳后不能任何条带，说明该PCR方法仅对PCV2是特异的。

图3 PCV2特异性检测结果

2.5 重复性检测

PCR扩增后凝胶电泳结果表明，3个样品6次重复均检测出阳性条带,证明该方法具有良好的可重复性和稳定性。

2.6 测序

PCR产物经克隆测序后，在NCBI数据库中比对分析表明，扩增得到的DNA片段与Genbank数据库收录的29种PCV2核酸片段的同源性都在96%以上。证实扩增的条带就是PCV2的核酸序列。

2.7 浙江地区流行情况调查

采样的142份病料中，经我们的PCR检测后有80份为阳性，阳性率达56.3%。说明PCV2病毒已经广泛存在于浙江省各大猪场，这对生猪饲养业的疾病防控提出了挑战。

3 讨论

传统的PCV2检测方法有酶联免疫吸附实验（ELISA）、原位核酸杂交（ISH）和免疫组化实验（IHC）等方法，这些方法操作复杂、检测时间长、存在非特异性反应和敏感度低等缺点，难以满足生猪养殖业疾病防控快速响应的需求。随着分子生物学的发展，PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测快捷等特点，已经广泛应用于快速高效地对细菌和病毒等病原体的检测。成功的PCR反应既要高效，又要特异，其关键在于引物的设计。一对好的引物设计就是在扩增效率和特异性之间寻求平衡。本研究引物设计的依据是通过比对Genebank收录的大量PCV2核苷酸序列，在其保守区域内寻找引物位点。最终我们设计出的引物可以特异地扩增出PCV2的相应条带，而对PRV，PPV和PCV1等病毒基因组模板不能扩增出条带,说明本方法用来作为诊断PCV2感染是有效可行的。该方法从核酸的制备到检测出结果约需4h，大大缩短了检测时间，可用于疑似PCV2感染病猪的快速诊断及分子流行病学调查，为规模化猪场有效诊断防治猪圆环病毒病提供了参考依据。